ພວກເຮົາໄດ້ຮັບປະສົບການຜູ້ຜະລິດ.ຊະນະສ່ວນໃຫຍ່ໃນການຢັ້ງຢືນທີ່ສໍາຄັນຂອງຕະຫຼາດຂອງຕົນສໍາລັບການຫຼຸດຂະຫນາດໃຫຍ່ຂອງຈີນຄວາມອ່ອນໄຫວສູງ Probe ຫນຶ່ງຂັ້ນຕອນ Rt-Qpcrຊຸດ V2, ຄຸນນະພາບແມ່ນໂຮງງານ' ຊີວິດ , ເນັ້ນໃສ່ຄວາມຕ້ອງການຂອງລູກຄ້າເປັນແຫຼ່ງຂອງການຢູ່ລອດແລະການພັດທະນາຂອງບໍລິສັດ, We adhere to honesty and good faith working attitude, looking forward to your coming !
ພວກເຮົາໄດ້ຮັບປະສົບການຜູ້ຜະລິດ.Wining ສ່ວນໃຫຍ່ຂອງການຢັ້ງຢືນທີ່ສໍາຄັນຂອງຕະຫຼາດຂອງຕົນສໍາລັບການຈີນ Taq DNA Polymerase, Qpcr, ບໍລິສັດຂອງພວກເຮົາສັນຍາວ່າ: ລາຄາທີ່ເຫມາະສົມ, ເວລາການຜະລິດສັ້ນແລະການບໍລິການຫລັງການຂາຍທີ່ຫນ້າພໍໃຈ, ພວກເຮົາຍັງຍິນດີຕ້ອນຮັບທ່ານໄປຢ້ຽມຢາມໂຮງງານຂອງພວກເຮົາໄດ້ທຸກເວລາທີ່ທ່ານຕ້ອງການ.ຂໍ​ໃຫ້​ພວກ​ເຮົາ​ມີ​ທຸ​ລະ​ກິດ​ທີ່​ເປັນ​ສຸກ​ແລະ​ຍາວ​ນານ​ຮ່ວມ​ກັນ !!!

ລາຍລະອຽດ

ຊຸດນີ້ໃຊ້ລະບົບ lysis buffer ທີ່ເປັນເອກະລັກທີ່ສາມາດປ່ອຍ RNA ອອກຈາກຕົວຢ່າງເຊນທີ່ລ້ຽງໄວ້ຢ່າງໄວວາສໍາລັບປະຕິກິລິຍາ RT-qPCR, ດັ່ງນັ້ນການກໍາຈັດຂະບວນການຊໍາລະລ້າງ RNA ທີ່ໃຊ້ເວລາຫຼາຍແລະເຮັດວຽກຫຼາຍ.ແມ່ແບບ RNA ສາມາດໄດ້ຮັບໃນເວລາພຽງ 7 ນາທີ.ການປະສົມ 5×Direct RT ແລະ 2×Direct qPCR Mix-SYBR reagents ທີ່ສະໜອງໃຫ້ໂດຍຊຸດສາມາດໄດ້ຮັບຜົນໄດ້ຮັບ PCR ທີ່ເປັນປະລິມານໃນເວລາຈິງໄດ້ຢ່າງວ່ອງໄວ ແລະມີປະສິດທິຜົນ.

5 × Direct RT Mix ແລະ 2 × Direct qPCR Mix-SYBR ມີຄວາມທົນທານຕໍ່ inhibitor ທີ່ເຂັ້ມແຂງ, ແລະ lysate ຂອງຕົວຢ່າງສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເປັນແມ່ແບບສໍາລັບ RT-qPCR ໂດຍກົງ.ຊຸດນີ້ປະກອບດ້ວຍ RNA ທີ່ມີຄວາມສອດຄ່ອງສູງຂອງ Foregene reverse transcriptase, ແລະ Hot D-Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl₂, ຕິກິຣິຍາ buffer, PCR optimizer ແລະ stabilizer.

ຂໍ້ມູນຈໍາເພາະ

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

ອົງປະກອບຊຸດ

ຄຸນ​ນະ​ສົມ​ບັດ​ແລະ​ຂໍ້​ດີ​

■ ງ່າຍ​ດາຍ​ແລະ​ປະ​ສິດ​ທິ​ຜົນ​: ດ້ວຍ​ເຕັກ​ໂນ​ໂລ​ຊີ Cell Direct RT​, ຕົວ​ຢ່າງ RNA ສາ​ມາດ​ໄດ້​ຮັບ​ໃນ​ພຽງ​ແຕ່ 7 ນາ​ທີ​.

■ ຄວາມຕ້ອງການຕົວຢ່າງມີຂະຫນາດນ້ອຍ, ຕ່ໍາສຸດ 10 ຈຸລັງສາມາດທົດສອບໄດ້.

■ ກະແສໄຟຟ້າສູງ: ມັນສາມາດກວດຫາ RNA ໄດ້ໄວໃນເຊລທີ່ລ້ຽງຢູ່ໃນແຜ່ນ 384, 96, 24, 12, 6 ດີ.

■ DNA Eraser ສາມາດເອົາ genomes ທີ່ປ່ອຍອອກມາໄດ້ຢ່າງໄວວາ, ຫຼຸດຜ່ອນຜົນກະທົບຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຕໍ່ຜົນການທົດລອງຕໍ່ໄປ.

■ ລະບົບ RT ແລະ qPCR ທີ່ຖືກປັບປຸງໃຫ້ດີຂຶ້ນ ເຮັດໃຫ້ການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບ RT-PCR ສອງຂັ້ນຕອນມີປະສິດທິພາບ ແລະ PCR ມີຄວາມສະເພາະເຈາະຈົງ, ແລະທົນທານຕໍ່ກັບ RT-qPCR ປະຕິກິລິຍາ inhibitors.

ຄໍາຮ້ອງສະຫມັກຊຸດ

ຂອບເຂດການນຳໃຊ້: ເຊລທີ່ລ້ຽງ.

- RNA ປ່ອຍອອກມາໂດຍ lysis ຕົວຢ່າງ: ໃຊ້ໄດ້ກັບແມ່ແບບ RT-qPCR ຂອງຊຸດນີ້ເທົ່ານັ້ນ.

- ຊຸດສາມາດນໍາໃຊ້ໄດ້ສໍາລັບຈຸດປະສົງດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້: ການວິເຄາະການສະແດງອອກຂອງເຊື້ອ, ການກວດສອບຜົນກະທົບຂອງ siRNA-mediated gene silencing, ການກວດສອບຢາເສບຕິດ, ແລະອື່ນໆ.

ແຜນວາດ

ການເກັບຮັກສາແລະອາຍຸການເກັບຮັກສາ

ສ່ວນ I ຂອງຊຸດນີ້ຄວນເກັບຮັກສາໄວ້ຢູ່ທີ່ 4 ℃;ພາກທີ II ຄວນເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -20 ℃.

Foregene Protease Plus II ຄວນເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ 4 ℃, ຢ່າແຊ່ແຂງຢູ່ທີ່ -20 ℃.

Reagent 2 × Direct qPCR Mix-SYBR ຄວນຖືກເກັບໄວ້ທີ່ -20 ℃ໃນບ່ອນມືດ;ຖ້າ​ຫາກ​ວ່າ​ນໍາ​ໃຊ້​ເລື້ອຍໆ​, ມັນ​ຍັງ​ສາ​ມາດ​ໄດ້​ຮັບ​ການ​ເກັບ​ຮັກ​ສາ​ໄວ້​ໃນ 4 ℃​ສໍາ​ລັບ​ການ​ເກັບ​ຮັກ​ສາ​ໃນ​ໄລ​ຍະ​ສັ້ນ (ໃຊ້​ເຖິງ​ພາຍ​ໃນ 10 ມື້​)​.Wining the majority in the crucial certifications of its market for Big discounting China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, Quality is factory' life , Focus on customer' demand is the source of company survival and development, We adhere to honesty and good faith working attitude, looking forward to your coming !
ສ່ວນຫຼຸດໃຫຍ່ຈີນ Taq DNA Polymerase, Qpcr, ບໍລິສັດຂອງພວກເຮົາສັນຍາວ່າ: ລາຄາທີ່ເຫມາະສົມ, ເວລາການຜະລິດສັ້ນແລະການບໍລິການຫລັງການຂາຍທີ່ຫນ້າພໍໃຈ, ພວກເຮົາຍັງຍິນດີຕ້ອນຮັບທ່ານໄປຢ້ຽມຢາມໂຮງງານຂອງພວກເຮົາໄດ້ທຸກເວລາທີ່ທ່ານຕ້ອງການ.ຂໍ​ໃຫ້​ພວກ​ເຮົາ​ມີ​ທຸ​ລະ​ກິດ​ທີ່​ເປັນ​ສຸກ​ແລະ​ຍາວ​ນານ​ຮ່ວມ​ກັນ !!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -ຕາກມan

Cat.No.DRT-01021/01022

ສໍາລັບເຊນໂດຍກົງ RT-qPCR ໂດຍໃຊ້ ≤ 1000,000 ເຊລ

ການແນະນໍາຜະລິດຕະພັນ

ຜະລິດຕະພັນນີ້ໃຊ້ລະບົບ lysis buffer ທີ່ເປັນເອກະລັກເພື່ອປ່ອຍ RNA ອອກຈາກຕົວຢ່າງເຊນທີ່ລ້ຽງໄວ້ຢ່າງໄວວາສໍາລັບປະຕິກິລິຍາ RT-qPCR, ກໍາຈັດຂະບວນການຊໍາລະລ້າງ RNA ທີ່ໃຊ້ເວລາຫຼາຍແລະເຮັດວຽກຫນັກ, ແລະພຽງແຕ່ 7 ນາທີເພື່ອໃຫ້ໄດ້ແມ່ແບບ RNA ທີ່ຕ້ອງການ, ດ້ວຍ 5 × Direct RT Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman ຜົນໄດ້ຮັບຢ່າງໄວວາແລະໃຊ້ເວລາທີ່ແທ້ຈິງ.

5 × Direct RT Mix ແລະ 2 × Direct qPCR Mix-Taqman ມີຄວາມທົນທານຕໍ່ inhibitor ທີ່ເຂັ້ມແຂງແລະສາມາດປະຕິບັດການປີ້ນກັບກັນທີ່ມີປະສິດທິພາບແລະການຂະຫຍາຍສະເພາະໂດຍໃຊ້ lysate ຂອງຕົວຢ່າງທີ່ຈະວັດແທກເປັນແມ່ແບບ.ທາດປະຕິກອນປະກອບດ້ວຍ Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer and Stabilizer, ເຊິ່ງສາມາດນໍາໃຊ້ກັບ lysis buffer ເພື່ອກວດຫາຕົວຢ່າງໄດ້ໄວແລະງ່າຍດາຍ, ແລະມີຄຸນລັກສະນະຂອງຄວາມອ່ອນໄຫວສູງ, ສະເພາະແລະຄວາມຫມັ້ນຄົງ.

ຄຸນສົມບັດຂອງຜະລິດຕະພັນ

ເທັກໂນໂລຍີ Cell Direct RT ງ່າຍໆ ແລະມີປະສິດທິພາບທີ່ຈະໃຊ້ເວລາພຽງ 7 ນາທີເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຕົວຢ່າງ RNA.

ຄວາມຕ້ອງການຕົວຢ່າງແມ່ນຂະຫນາດນ້ອຍ, ແລະຢ່າງຫນ້ອຍ 10 ຈຸລັງວັດທະນະທໍາສາມາດນໍາໃຊ້ສໍາລັບການທົດລອງ.

ກະແສໄຟຟ້າສູງສໍາລັບການໄດ້ຮັບ RNA ຢ່າງໄວວາຂອງຈຸລັງວັດທະນະທໍາເຊັ່ນ 384, 96, 24, 12, ແລະ 6-ດີແຜ່ນ.

DNA Eraser ສາມາດເອົາ genomes ທີ່ປ່ອຍອອກມາໄດ້ຢ່າງໄວວາ, ຫຼຸດຜ່ອນຜົນກະທົບຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຕໍ່ຜົນການທົດລອງຕໍ່ໄປ.

ລະບົບ RT ແລະ qPCR ທີ່ຖືກປັບປຸງໃຫ້ດີຂຶ້ນເຮັດໃຫ້ RT-PCR ສອງຂັ້ນຕອນທີ່ມີການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນທີ່ມີປະສິດທິພາບຫຼາຍຂຶ້ນ, ຄວາມສະເພາະ, ແລະຄວາມທົນທານຂອງປະຕິກິລິຍາ RT-qPCR ທີ່ແຂງແຮງກວ່າ.

ຄໍາຮ້ອງສະຫມັກຊຸດ

ຂອບເຂດການນຳໃຊ້: ເຊລທີ່ລ້ຽງ.

ຕົວຢ່າງ lysis ຕີຄວາມໝາຍ RNA: ໃຊ້ເປັນແມ່ແບບ RT-qPCR ສອງຂັ້ນຕອນເທົ່ານັ້ນ.

ຊຸດສາມາດໃຊ້ເພື່ອຈຸດປະສົງຕໍ່ໄປນີ້: ການວິເຄາະການສະແດງອອກຂອງ gene, ການທົດສອບ allele, ການກວດຢາ, ແລະອື່ນໆ.

ຂໍ້ຈຳກັດຂອງຊຸດ

ຊິ້ນສ່ວນຂະຫຍາຍ ≤ 300 bp.

ຊຸດໃຊ້ເພື່ອປູກຝັງຈຸລັງສົດໆ.

ການຄວບຄຸມຄຸນນະພາບຜະລິດຕະພັນ

ອີງຕາມລະບົບການຄຸ້ມຄອງຄຸນນະພາບທັງໝົດຂອງ FOREGENE, ແຕ່ລະຊຸດຂອງຊຸດຊຸດ Cell Direct RT-qPCR ຖືກທົດສອບຢ່າງເຂັ້ມງວດຫຼາຍຄັ້ງເພື່ອຮັບປະກັນຄວາມໜ້າເຊື່ອຖື ແລະ ຄວາມໝັ້ນຄົງຂອງຄຸນນະພາບຂອງຊຸດຊຸດແຕ່ລະຊຸດ.

ເນື້ອໃນຊຸດ

*:Cell Lysis, 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman ສາມາດຊື້ໄດ້ແຍກຕ່າງຫາກ, ລາຍລະອຽດແມ່ນໃຫ້ຢູ່ໃນເອກະສານຊ້ອນທ້າຍ 1 (ໜ້າ 13).

ເງື່ອນໄຂການເກັບຮັກສາ

1. ເງື່ອນໄຂການຂົນສົ່ງ

ຂະບວນການທັງຫມົດຂອງການຂົນສົ່ງກ່ອງກ້ອນທີ່ມີອຸນຫະພູມຕ່ໍາ, ເພື່ອຮັບປະກັນວ່າຊຸດຢູ່ໃນສະພາບ <4 °C.

2. ເງື່ອນໄຂການເກັບຮັກສາ

ເກັບຮັກສາສ່ວນທີ I ຢູ່ທີ່ 4 ° C ແລະສ່ວນ II ຢູ່ທີ່ -20 ° C.

Foregene Protease Plus II ຄວນເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ 4 ° C, ບໍ່ແຊ່ແຂງຢູ່ທີ່ -20 ° C.

Reagent 2 × Direct qPCR Mix-Taqman ຖືກເກັບໄວ້ທີ່ -20 ° C, ຫຼືຢູ່ທີ່ 4 ° C ສໍາລັບການນໍາໃຊ້ໃນໄລຍະສັ້ນຖ້າຖືກນໍາໃຊ້ເລື້ອຍໆ (ພາຍໃນ 10 ມື້).

ຂໍ້ມູນອົງປະກອບຊຸດ

Buffer CL: ສະຫນອງສະພາບແວດລ້ອມທີ່ຈໍາເປັນສໍາລັບປະຕິກິລິຍາ lysis ຂອງເຊນ.

Buffer ST: ຢຸດເຊົາສານທີ່ຫ້າວຫັນໃນ lysate ເພື່ອຫຼີກເວັ້ນຜົນກະທົບຕໍ່ RT ຕໍ່ມາ.

DNA Eraser: ການກໍາຈັດ DNA, ຜົນກະທົບຂອງການກໍາຈັດ genome ໃນການທົດລອງຕໍ່ໄປ.

5× Direct RT Mix: ບັນຈຸມີ RNA affinity ສູງ Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTPs, stabilizers, enhancers, optimizers, and reverse transcription primers for optimal alignment (Random Primer, Oligo(dT))₁₈primer).

Foregene Protease Plus II: ໃນສະພາບການຂອງ lysis buffer, ຈຸລັງຖືກ lysed ເພື່ອປ່ອຍອາຊິດນິວຄລີອິກ.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: ທາດປະສົມນີ້ປະກອບດ້ວຍ Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, ຕິກິຣິຍາ buffer, PCR optimizer, ແລະ stabilizer.

20× ROX Reference Dye: ໂດຍທົ່ວໄປແລ້ວໃຊ້ໃນເຄື່ອງຂະຫຍາຍ PCR ໃນເວລາຈິງຂອງ ABI, Stratagene ແລະບໍລິສັດອື່ນໆ, ມັນຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອປັບຄວາມແຕກຕ່າງລະຫວ່າງທໍ່ PCR ແລະທໍ່ທີ່ເກີດຈາກຄວາມຜິດພາດຂອງ PCR dosing.ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງສີຍ້ອມຜ້າອ້າງອິງ 20 × ROX ທີ່ຕ້ອງການສໍາລັບເຄື່ອງມືທີ່ແຕກຕ່າງກັນ, ແລະຜູ້ໃຊ້ສາມາດເພີ່ມມັນຕາມຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງເຄື່ອງມືທີ່ແນະນໍາ.

RNase-Free ddH₂O: ນ້ໍາບໍລິສຸດ ultra sterilized ທີ່ບໍ່ມີ RNase ສໍາລັບປະຕິກິລິຍາ RT-qPCR ສອງຂັ້ນຕອນ.

ການ​ປ້ອງ​ກັນ​ລ່ວງ​ໜ້າ:(ໃຫ້​ແນ່​ໃຈວ່​າ​ອ່ານ​ຂໍ້​ຄວນ​ລະ​ມັດ​ລະ​ວັງ​ກ່ອນ​ທີ່​ຈະ​ນໍາ​ໃຊ້​ຊຸດ​)

ເອົາໃຈໃສ່ກັບວິທີການປະຕິບັດງານຂອງການທົດລອງເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການປົນເປື້ອນລະຫວ່າງຕົວຢ່າງ.

ເອົາໃຈໃສ່ກັບຄວາມສະອາດຂອງສະພາບແວດລ້ອມທົດລອງແລະເຄື່ອງໃຊ້ເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການປົນເປື້ອນ RNase ແລະການເຊື່ອມໂຊມຂອງ RNA.

ເອົາຕົວຢ່າງເຊລທີ່ສົດ ຫຼືເກັບຮັກສາໄວ້ດີ ແລະບໍ່ເຄີຍໃຊ້ຕົວຢ່າງເຊລທີ່ແຊ່ແຂງຊ້ຳແລ້ວຊ້ຳອີກ.

5× Direct qPCR Mix,2× Direct qPCR Mix-Taqman ຄວນຫຼີກລ້ຽງການແຊ່ແຂງຊ້ຳໆ, ຖ້າບໍ່ດັ່ງນັ້ນມັນຈະສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນ ແລະປະສິດທິພາບ PCR.

ກຽມເງິນສ່ວນກ່ອນການດໍາເນີນງານ

ໃຫ້ແນ່ໃຈວ່າອ່ານຄໍາແນະນໍາຢ່າງລະອຽດກ່ອນທີ່ຈະໃຊ້ຊຸດນີ້.ຊຸດ Cell Direct RT-qPCR ແມ່ນງ່າຍດາຍ, ສະດວກ, ແລະໄວໃນການດໍາເນີນງານ, ແລະຄໍາແນະນໍາໃຫ້ຂໍ້ມູນຄົບຖ້ວນສົມບູນກ່ຽວກັບຊຸດທັງຫມົດແລະວິທີການນໍາໃຊ້ຢ່າງຖືກຕ້ອງ.ກະລຸນາກະກຽມອຸປະກອນ ແລະອຸປະກອນທົດລອງທີ່ຈຳເປັນກ່ອນນຳໃຊ້.

ອຸ​ປະ​ກອນ​ການ​ທົດ​ລອງ​ແລະ​ອຸ​ປະ​ກອນ​

◆ຈຸລັງວັດທະນະທໍາ.

◆ 1.5 ມລ ຫຼື 2 ມລ, ທໍ່ RNase-/DNase-Free centrifuge, ປາຍ RNase-/DNase-Free, ທໍ່ qPCR sterile 0.2 ml.

◆ເຄື່ອງ qPCR, pipette, centrifuge tabletop (≥13,400×g) (ຂຶ້ນກັບຄວາມຕ້ອງການທົດລອງ), ແລະອື່ນໆ.

ຄວາມປອດໄພ

◆ຜະລິດຕະພັນນີ້ແມ່ນສໍາລັບຈຸດປະສົງການຄົ້ນຄວ້າວິທະຍາສາດເທົ່ານັ້ນ, ກະລຸນາຢ່າໃຊ້ມັນສໍາລັບຈຸດປະສົງທາງຢາ, ທາງດ້ານການຊ່ວຍ, ອາຫານແລະເຄື່ອງສໍາອາງ.

◆ ເມື່ອໃຊ້ສານເຄມີ, ໃຫ້ໃສ່ເຄື່ອງນຸ່ງຫ້ອງທົດລອງທີ່ເຫມາະສົມ, ຖົງມື, ແວ່ນຕາປ້ອງກັນ, ແລະອື່ນໆ.

ການດໍາເນີນງານຄູ່ມື

ລະບົບ Cell Lysis, ລະບົບ RT, ແລະຊຸດເສີມການແກ້ໄຂປະຕິກິລິຍາ qPCR ສາມາດຊື້ໄດ້ແຍກຕ່າງຫາກ, ສໍາລັບລາຍລະອຽດໃນເອກະສານຊ້ອນທ້າຍ 1 (PAGE 13).

ຄູ່ມືການປະຕິບັດ

A: ຕົວຢ່າງການປ່ອຍ RNA

1. Cells ໄດ້ຖືກ pretreated: ລ້າງແຜ່ນວັດທະນະທໍາຈຸລັງດ້ວຍ PBS ເຢັນ, ຫຼັງຈາກນັ້ນ lyse ຈຸລັງ (10-10.⁶), 10⁶ ຫຼາຍກ່ວາຈໍານວນຈຸລັງ, ແມ່ນແນະນໍາ Foregene the Cell an RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) ຫຼື Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) ສໍາລັບການສະກັດເອົາແລະການຊໍາລະລ້າງ RNA.

1.1.ຈຸລັງທີ່ຕິດກັນ (24- ດີແຜ່ນເປັນຕົວຢ່າງ)

1.1.1.ກໍານົດຈໍານວນຂອງຈຸລັງໃນແຕ່ລະຂຸມ, ກໍານົດວ່າຈໍານວນຂອງຈຸລັງແມ່ນ 1 × 10⁵, ແລະໃຊ້ທໍ່ເພື່ອເອົາສື່ວັດທະນະທໍາອອກຈາກອາຫານວັດທະນະທໍາ.

1.1.2.ຕື່ມ 200 μlຂອງ pre-chilled 1 × PBS ກັບແຕ່ລະດີ.ຢ່າທໍ່ນໍ້າຊ້ຳໆ ແລະເອົາ PBS ອອກຈາກນໍ້າສ້າງ.ອຽງແຜ່ນແລະເອົາ PBS ອອກຫຼາຍເທົ່າທີ່ເປັນໄປໄດ້.ດໍາເນີນຂັ້ນຕອນທີ 2.

1.1.3.ຖ້ວຍວັດທະນະທໍາເຊນທີ່ແຕກຕ່າງກັນຫຼືຕາຕະລາງຫມາຍເລກອ້າງອິງ 1-1 ໃນອາຫານວັດທະນະທໍາຈຸລັງໄດ້ຖືກເພີ່ມ precooled 1 × PBS ສໍາລັບການລ້າງຈຸລັງ.

ຕາຕະລາງ 1-1: ປະລິມານ PBS ສໍາລັບຈໍານວນຈຸລັງທີ່ແຕກຕ່າງກັນ

ຫມາຍ​ເຫດ​:ເພື່ອຮັບປະກັນຈຸລັງທີ່ຍຶດຫມັ້ນ,ການ​ສູນ​ເສຍ​ເຊ​ລ​ຈໍາ​ນວນ​ຫຼາຍ​ຫຼີກ​ເວັ້ນ​ການ​ໃນ​ເວ​ລາ​ທີ່​ລ້າງ​.

1.2.ຈຸລັງ suspension ຫຼືຈຸລັງທີ່ຕິດກັນທີ່ລ້ຽງຢູ່ໃນແຜ່ນທີ່ບໍ່ມີ porous

1.2.1.ຈຸລັງທີ່ຕິດກັນທີ່ລ້ຽງຢູ່ໃນແຜ່ນທີ່ບໍ່ມີຫຼາຍ (ຈຸລັງ suspension ເລີ່ມຈາກຂັ້ນຕອນຕໍ່ໄປ 1.2.2), ລວບລວມແລະແຍກຈຸລັງຕາມວິທີການເກັບຈຸລັງປົກກະຕິ, ແລະວາງໄວ້ໃນແຜ່ນວັດທະນະທໍາຫຼືທໍ່ centrifuge;ຖ້າ trypsinization ຖືກນໍາໃຊ້, ຕ້ອງການ centrifugation ເພື່ອເກັບກໍາຈຸລັງແລະເອົາ trypsin ສ່ວນທີ່ເຫຼືອ, ເພີ່ມຈຸລັງ PBS resuspended ເຂົ້າໄປໃນແຕ່ລະຈຸລັງເພື່ອກະຈາຍຈຸລັງ.

1.2.2.ຫຼັງ​ຈາກ​ຈໍາ​ນວນ​ຂອງ​ເຊ​ລ​ທີ່​ນັບ​ໄດ້​, ເຊ​ລ aliquoted 1 × 10​⁵ ຫນຶ່ງຫາທໍ່ centrifuge, ເກັບກໍາຈຸລັງໂດຍການ centrifugation ຢູ່ທີ່ 1000 × g ສໍາລັບ 10 min.

1.2.3.ຕື່ມ 200 μl PBS ເຂົ້າໄປໃນທໍ່ centrifuge, ຢ່າທໍ່ນ້ໍາຊ້ໍາຊ້ອນ, ແລະດູດຊຶມ PBS ໂດຍກົງ.ດຳ​ເນີນ​ການ​ຂັ້ນ​ຕອນ​ທີ 2. (ຖ້າ​ຫາກ​ຍາກ​ທີ່​ຈະ​ເກີດ​ຝົນ​ຕົກ ແລະ​ຈຸລັງ​ຖືກ​ຢຸດ​ຄືນ​ໃໝ່​ອີກ, ອາດ​ຈະ​ຖືກ​ດຳ​ເນີນ​ການ 1000×g centrifuged 10 ນາ​ທີ ຫຼັງ​ຈາກ​ການ​ປະ​ຖິ້ມ supernatant, ເມັດ cell ດຳ​ເນີນ​ການ​ຂັ້ນ​ຕອນ​ທີ 2).

2.Cell lysis: Remove Buffer CL, ອຸນຫະພູມຂອງມັນ equilibated ກັບອຸນຫະພູມຫ້ອງ, DNA Eraser ແລະ Foregene Protease Plus II, ອີງຕາມຕາຕະລາງຕໍ່ໄປນີ້ 1-2 ລະບົບ lysis ກະກຽມ: (ການແກ້ໄຂ Lysis ແມ່ນກຽມພ້ອມສໍາລັບການນໍາໃຊ້).

ຕາຕະລາງ 1-2: ການແຕກແຍກ ການ​ກະ​ກຽມ​ລະ​ບົບ (ຫມາຍ​ເຫດ​: ໃນ​ການ​ກະ​ກຽມ​ກ່ຽວ​ກັບ​ກ້ອນ​)

3.( 24 – well plate as an example ) Pipette 200 μl ຂອງ cell lysis master mix ເຂົ້າໄປໃນແຕ່ລະດີ, ຟັນຊ້ໍາ 5-10 ເທື່ອ, ອົບໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ (20-25 ℃) ເປັນເວລາ 5 ນາທີ.

ຫມາຍ​ເຫດ​:ເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການສ້າງຕັ້ງຂອງຟອງ, ກະລຸນາໃນເວລາທີ່ pipette ຂະຫນາດໄດ້ຖືກປັບເປັນ200μlຫຼືຫນ້ອຍ.ຈຸລັງອາດຈະປະກົດມີເມຄຫຼັງຈາກ lysis, ເຊິ່ງເປັນເລື່ອງປົກກະຕິ.

4.(24 – well plate as an example) ໄດ້ຖືກເພີ່ມໃສ່ໃນຂອງແຫຼວ 20 μl Buffer ST (ລະບົບ lysis ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ Buffer ST ເພີ່ມໃນປະລິມານທີ່ສະແດງໃນຕາຕະລາງ 1-3), ທໍ່ທໍ່ຊ້ໍາຊ້ອນ 5-10 ເທື່ອ, ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ (20-25 ℃) incubated ສໍາລັບ 2 min .

ຫມາຍ​ເຫດ​:ປາຍ pipette ຖິ້ມໄວ້ຂ້າງລຸ່ມ, ຮັບປະກັນວ່າ lysate ໄດ້ຖືກເພີ່ມ,ເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການສ້າງຕັ້ງຂອງຟອງ, ກະລຸນາໃນເວລາທີ່ pipette ຂະຫນາດໄດ້ຖືກປັບເປັນ 200μlຫຼືຫນ້ອຍ.

ຕາຕະລາງ 1-3:ເພີ່ມ Buffer ST

5.The lysate ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການທົດລອງ RT-qPCR ຕໍ່ມາ.ຖ້າ​ຫາກ​ວ່າ​ການ​ທົດ​ລອງ​ຕໍ່​ມາ​ບໍ່​ສາ​ມາດ​ປະ​ຕິ​ບັດ​ໄດ້​ທັນ​ເວ​ລາ​, ກະ​ລຸ​ນາ​ເກັບ​ໄວ້​ໃນ​ກ້ອນ​ສໍາ​ລັບ​ການ​ບໍ່​ເກີນ 2 ຊົ່ວ​ໂມງ​, ແລະ​ເກັບ​ຮັກ​ສາ​ໄວ້​ທີ່ -20 ℃​ຫຼື -80 ℃ (ບໍ່​ເກີນ​ສາມ​ເດືອນ​)​.

B: ການກະກຽມລະບົບ RT

1. ເອົາອອກ 5 × Direct RT Mix ແລະວາງໃສ່ອາບນ້ໍາກ້ອນ, ປ່ອຍໃຫ້ມັນລະລາຍຕາມທໍາມະຊາດ, ແລະຄ່ອຍໆປະສົມມັນສໍາລັບການນໍາໃຊ້ໃນພາຍຫລັງ;ເອົາ RNase-Free ddH2O ອອກແລ້ວລະລາຍມັນ ແລະວາງໃສ່ອາບນໍ້າກ້ອນເພື່ອໃຊ້ໃນພາຍຫຼັງ.ກະກຽມລະບົບຕິກິຣິຍາເທິງກ້ອນຕາມຕາຕະລາງ 2-1 ຂ້າງລຸ່ມນີ້.

ຕາຕະລາງ 2-1: ການກະກຽມລະບົບຕິກິຣິຍາ RT

2.After ສໍາ​ເລັດ​ການ​ສ້າງ​ລະ​ບົບ​, ຄ່ອຍໆ​ປະ​ສົມ​ແລະ centrifuged ໂດຍ​ຫຍໍ້​ໃນ​ຕາ​ຕະ​ລາງ​ດັ່ງ​ຕໍ່​ໄປ​ນີ້ 2 -2 ເງື່ອນ​ໄຂ​ຕິ​ກິ​ຣິ​ຍາ RT​.

ຕາຕະລາງ 2-2: ການຕັ້ງຄ່າເງື່ອນໄຂຂອງປະຕິກິລິຍາ RT

3.After ສໍາ​ເລັດ​ການ​ຕິ​ກິ​ຣິ​ຍາ​, ຜະ​ລິດ​ຕະ​ພັນ​ຕິ​ກິ​ຣິ​ຍາ​ໄດ້​ຖືກ​ຈັດ​ໃສ່​ໂດຍ​ກົງ​ກ່ຽວ​ກັບ​ກ້ອນ​ສໍາ​ລັບ qPCR​, ກະ​ລຸ​ນາ​ເຮັດ​ໃຫ້​ການ​ປົກ​ປັກ​ຮັກ​ສາ​ໃນ​ໄລ​ຍະ​ຍາວ -20 ℃​ຫຼື -80 ℃​.

ໝາຍເຫດ: ເນື່ອງຈາກການໃຊ້ແມ່ແບບທີ່ບໍ່ມີການຊໍາລະ, precipitates ສີຂາວອາດຈະປາກົດຢູ່ໃນຜະລິດຕະພັນການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນ.ນີ້ແມ່ນປະກົດການປົກກະຕິ.Centrifuge the supernatant ທັນທີສໍາລັບການທົດລອງຕໍ່ໄປ.

ການແກ້ໄຂປະຕິກິລິຢາ RT ທີ່ໄດ້ຮັບຜົນໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໃນລະບົບຕິກິຣິຍາ PCR ຂັ້ນຕອນຕໍ່ໄປ, ແນະນໍາໃຫ້ເພີ່ມປະລິມານຈາກ 10-30% ຂອງລະບົບຕິກິຣິຍາ.

C: qPCR ການກະກຽມລະບົບຕິກິຣິຍາ

1. ຈໍານວນທີ່ເຫມາະສົມຂອງ B ກະກຽມໃນຂັ້ນຕອນ cDNA template ຕາມຕາຕະລາງ 3-1 ຕໍ່ໄປນີ້ເພື່ອກະກຽມລະບົບຕິກິຣິຍາ.

ຫມາຍເຫດ: ຈໍານວນແມ່ແບບ cDNA ກວມເອົາ 10-30% ຂອງລະບົບ qPCR.ຕົວຢ່າງ, ໃນລະບົບ 20μl qPCR, ເພີ່ມ 2-6 μlຂອງ lysis buffer, ແຕ່ບໍ່ເກີນ 6 μl.

2.ການ​ປັບ​ປຸງ​ເງື່ອນ​ໄຂ​ທີ່​ດີ qPCR (ອຸນ​ຫະ​ພູມ Annealing​, ແລະ​ອື່ນໆ​) ສໍາ​ລັບ​ການ​ຕິ​ກິ​ຣິ​ຍາ qPCR (ເງື່ອນ​ໄຂ​ຕິ​ກິ​ຣິ​ຍາ​ໃຫ້​ຢູ່​ໃນ​ຕາ​ຕະ​ລາງ 3-2​)​.

ຫມາຍເຫດ: ພະຍາຍາມໃຊ້ເງື່ອນໄຂທີ່ດີທີ່ສຸດສໍາລັບປະຕິກິລິຍາ qPCR ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຜົນໄດ້ຮັບທີ່ດີກວ່າ.

ຕາຕະລາງ 3-1: ການກະກຽມລະບົບປະຕິກິລິຍາ PCR

1*: ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ primer ສາມາດປັບໄດ້ໃນລະດັບ 50-900 nM ໃນເວລາທີ່ການປະຕິບັດປະຕິກິລິຍາ primer ແມ່ນບໍ່ດີ.

ຫມາຍເຫດ: ລະບົບ qPCR ສາມາດປັບໄດ້ຕາມຄວາມຕ້ອງການໃນການທົດລອງແລະຮູບແບບ fluorescence cycler.ສໍາລັບ qPCR ໃນ 50μl ລະບົບ, ປັບປະລິມານ reagent ຕາມອັດຕາສ່ວນຕາມ 20μl ລະບົບ.

2*: ເລືອກຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສຸດທ້າຍທີ່ເຫມາະສົມຂອງສີຍ້ອມຜ້າອ້າງອິງ ROX ອີງຕາມການ fluorescence quantitative thermal cycler.ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງສີຍ້ອມ ROX ທີ່ເຫມາະສົມທີ່ສຸດສໍາລັບ cyclers fluorescence ທົ່ວໄປແມ່ນສະແດງຢູ່ໃນຕາຕະລາງຂ້າງລຸ່ມນີ້:

ຕາຕະລາງ 3-2: ເງື່ອນໄຂຕິກິຣິຍາ qPCR ແມ່ນສະຫນອງໃຫ້

ຫມາຍເຫດ: ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຜົນກະທົບ qPCR ທີ່ດີທີ່ສຸດ, gradient PCR ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອເພີ່ມປະສິດທິພາບເງື່ອນໄຂຕິກິຣິຍາສໍາລັບແມ່ແບບທີ່ແຕກຕ່າງກັນແລະ primers ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ.ເງື່ອນໄຂປະຕິກິລິຍາຂອງ PCR ແຕກຕ່າງກັນໄປຕາມເຄື່ອງວິເຄາະ fluorescence, ແມ່ແບບ, primer, ແລະອື່ນໆ. ໃນການປະຕິບັດສະເພາະ, ເງື່ອນໄຂການຕິກິຣິຍາທີ່ດີທີ່ສຸດຕ້ອງໄດ້ຮັບການອອກແບບຕາມເງື່ອນໄຂສະເພາະຂອງ fluorescence quantitative thermal cycler, ປະເພດແມ່ແບບ, ຂະຫນາດຂອງຊິ້ນສ່ວນທີ່ສົນໃຈ, ລໍາດັບພື້ນຖານຂອງຊິ້ນສ່ວນຂະຫຍາຍໃຫຍ່ຂື້ນແລະເນື້ອໃນ GC ແລະຄວາມຍາວຂອງ primers, ລວມທັງເວລາ, ອຸນຫະພູມ, ແລະອື່ນໆ.

ຫຼັກການການອອກແບບ primer PCR ໃນເວລາຈິງ

Forward Primer ແລະ Reverse Primer

ສໍາລັບ PCR ທີ່ແທ້ຈິງ, ການອອກແບບ primer ແມ່ນມີຄວາມສໍາຄັນຫຼາຍ.Primers ແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງກັບສະເພາະແລະປະສິດທິພາບຂອງການຂະຫຍາຍ PCR, ແລະສາມາດໄດ້ຮັບການອອກແບບໂດຍອ້າງອີງໃສ່ຫຼັກການດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້:

◆ຄວາມຍາວຂອງ primer: 18-30bp.

◆ເນື້ອໃນ GC: 40-60%.

◆ຄ່າ Tm: ຊອບແວອອກແບບ primer ເຊັ່ນ Primer 5 ສາມາດໃຫ້ຄ່າ Tm ຂອງ primer.ຄ່າ Tm ຂອງ primers ເທິງນ້ໍາແລະລຸ່ມຄວນຈະໃກ້ຊິດເທົ່າທີ່ເປັນໄປໄດ້.ສູດການຄິດໄລ່ Tm ຍັງສາມາດຖືກນໍາໃຊ້: Tm = 4 °C (G + C) + 2 ° C (A + T).ເມື່ອປະຕິບັດ PCR, ອຸນຫະພູມຕ່ໍາກວ່າຄ່າ primer Tm ຂອງ 5 ° C ໂດຍທົ່ວໄປແມ່ນເລືອກເປັນອຸນຫະພູມ annealing (ການເພີ່ມຂຶ້ນທີ່ສອດຄ້ອງກັນຂອງອຸນຫະພູມ annealing ສາມາດເພີ່ມຄວາມສະເພາະຂອງຕິກິຣິຍາ PCR).

◆ຜະລິດຕະພັນ Primers ແລະ PCR:

◆ການອອກແບບ primer PCR amplification ຄວາມຍາວຜະລິດຕະພັນແມ່ນມັກ 100-150bp.

◆ ການອອກແບບ primers ໃນເຂດໂຄງສ້າງຮອງຂອງແມ່ແບບຄວນຫຼີກເວັ້ນຫຼາຍເທົ່າທີ່ເປັນໄປໄດ້.

◆ ຫຼີກລ່ຽງການສ້າງຖານປະສົມ 2 ຫຼືຫຼາຍກວ່ານັ້ນລະຫວ່າງ 3′ ປາຍຂອງຕົ້ນນ້ຳເທິງ ແລະ ລຸ່ມນ້ຳ.

◆ primer 3′ terminal base ບໍ່ສາມາດມີ 3 G ຫຼື C ຕິດຕໍ່ກັນເພີ່ມເຕີມ.

◆ primers ຕົວເອງບໍ່ສາມາດມີໂຄງສ້າງເສີມ, ຖ້າບໍ່ດັ່ງນັ້ນໂຄງສ້າງ hairpin ຈະຖືກສ້າງຂື້ນ, ຜົນກະທົບຕໍ່ການຂະຫຍາຍ PCR.

◆ ATCG ຄວນແຈກຢາຍເທົ່າທີ່ເປັນໄປໄດ້ໃນລໍາດັບ primer, ແລະ 3′ terminal base ຄວນຖືກຫຼີກເວັ້ນເປັນ T.

ເອກະສານຊ້ອນທ້າຍ1:Cell DirectRT-qPCR ຊຸດສ່ວນປະກອບt ຊຸດເສີມ

1.Cell Lysis Solution