ການທົດລອງ RT-qPCR ປະກອບມີການສະກັດເອົາ RNA ແລະການປະເມີນຄຸນນະພາບ, ການຖອດຖອນຄືນໃຫມ່ແລະ qPCR ສາມຂັ້ນຕອນ, ແຕ່ລະຂັ້ນຕອນມີຄວາມລະມັດລະວັງຫຼາຍ, ພວກເຮົາຈະແນະນໍາໃນລາຍລະອຽດຂ້າງລຸ່ມນີ້.

Ⅰ.ການ​ປະ​ເມີນ​ຄຸນ​ນະ​ພາບ RNA​

ໃນການທົດລອງ RT-qPCR, ຫຼັງຈາກສໍາເລັດການສະກັດເອົາ RNA, ຄຸນນະພາບຂອງ RNA ຕ້ອງໄດ້ຮັບການປະເມີນ, ແລະການທົດລອງຕິດຕາມສາມາດປະຕິບັດໄດ້ພຽງແຕ່ຫຼັງຈາກໄດ້ມີຄຸນສົມບັດ.ວິທີການປະເມີນຜົນປະກອບມີ spectrophotometer, Agilent gel electrophoresis, ການວິເຄາະ Agilent 2100, ເຊິ່ງໃນນັ້ນແມ່ນໃຊ້ຫຼາຍທີ່ສຸດ spectrophotometer ແລະ agarose gel electrophoresis ວິທີການກວດພົບ.ມັນຄວນຈະສັງເກດວ່າທັງສອງວິທີການນີ້ຈໍາເປັນຕ້ອງໃຊ້ຮ່ວມກັນເພື່ອເຮັດສໍາເລັດການກວດສອບແລະການວິເຄາະຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ RNA, ຄວາມບໍລິສຸດແລະຄວາມສົມບູນ, ເພື່ອຮັບປະກັນຄຸນນະພາບຂອງ RNA.

ຊຸດການແຍກ RNA ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ: 

ຊຸດການແຍກ RNA ທັງໝົດຂອງເຊລ

RNA ທັງ ໝົດ ທີ່ບໍລິສຸດແລະມີຄຸນນະພາບສູງສາມາດໄດ້ຮັບຈາກຈຸລັງການລ້ຽງຕ່າງໆໃນ 11 ນາທີ.

ຊຸດການແຍກ RNA ທັງໝົດຂອງສັດ

ຢ່າງໄວວາແລະປະສິດທິພາບສະກັດ RNA ທັງຫມົດທີ່ມີຄວາມບໍລິສຸດແລະມີຄຸນນະພາບສູງຈາກເນື້ອເຍື່ອສັດຕ່າງໆ.

Spectrophotometer:

spectrophotometer ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນໃຊ້ເພື່ອກໍານົດຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນແລະຄວາມບໍລິສຸດຂອງ RNA, ແຕ່ມັນບໍ່ສາມາດກວດພົບຄວາມສົມບູນຂອງ RNA ແລະສານຕົກຄ້າງຂອງ genomic.ໃນບັນດາພວກມັນ, A260/280 ແລະ A260/230 ແມ່ນຕົວກໍານົດການທີ່ສໍາຄັນສໍາລັບການກວດສອບຄວາມບໍລິສຸດຂອງ RNA, ແລະຄວາມບໍລິສຸດຂອງ RNA ສາມາດກວດພົບໄດ້ຕາມຄວາມຜັນຜວນຂອງມູນຄ່າຂອງພວກເຂົາ:

1. 1.9< A260/280< 2.1, ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຄວາມບໍລິສຸດຂອງ RNA ແມ່ນດີ;A260/280<1.9, ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າອາດຈະມີທາດໂປຼຕີນທີ່ຕົກຄ້າງຢູ່ໃນ RNA;A260/280>2.1, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງການເຊື່ອມໂຊມບາງສ່ວນທີ່ເປັນໄປໄດ້ຂອງ RNA, ເຊິ່ງສາມາດຢືນຢັນຕື່ມອີກໂດຍ electrophoresis gel agarose.

2. 2.0< A260/230< 2.2, ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຄວາມບໍລິສຸດຂອງ RNA ແມ່ນດີ;A260/230< 2.0, ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າອາດມີສານຕົກຄ້າງຂອງທາດປະຕິກອນອິນຊີໃນ RNA, ເຊັ່ນ: ຟີນອລ, ເອທານອນ ຫຼືນໍ້າຕານ.

Agarose gel electrophoresis:

Agarose gel electrophoresis assay ສາມາດວິເຄາະຄວາມສົມບູນຂອງ RNA, genome ແລະທາດໂປຼຕີນທີ່ຕົກຄ້າງ, ແຕ່ບໍ່ສາມາດປະເມີນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ RNA ໄດ້ຢ່າງຖືກຕ້ອງຫຼືກວດພົບການຕົກຄ້າງຂອງທາດປະຕິກອນອິນຊີ.ເອົາແມ່ແບບ RNA eukaryotic ເປັນຕົວຢ່າງ:

1. RNA ແມ່ນຂຶ້ນກັບ agarose gel electrophoresis.ຖ້າມີພຽງແຕ່ສາມແຖບດຽວຂອງ 28sRNA, 18sRNA ແລະ 5.8sRNA ໃນແຜນທີ່ gel, ມັນຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ RNA ທີ່ຖືກສະກັດອອກແມ່ນ intact.ຖ້າມີປະກົດການລາກ, ມັນຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງການເຊື່ອມໂຊມບາງສ່ວນຂອງ RNA.

2. ຖ້າມີແຖບທີ່ສົດໃສອັນດຽວລະຫວ່າງຮູກາວແລະແຖບ 28sRNA, ອາດຈະມີການຕົກຄ້າງຂອງ genomic DNA.

3. ຖ້າແຖບປາກົດຢູ່ໃນຮູກາວ, ມັນຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າອາດຈະມີທາດໂປຼຕີນແລະສານ macromolecular ອື່ນໆທີ່ຕົກຄ້າງ.

Ⅱ. ການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນ

ຫຼັງຈາກການສະກັດເອົາ RNA ສໍາເລັດແລ້ວ, ມັນຈໍາເປັນຕ້ອງຖືກປ່ຽນເປັນ cDNA ສໍາລັບການທົດລອງຕໍ່ໄປ, ດັ່ງນັ້ນຂັ້ນຕອນການຖອນຄືນແມ່ນຈໍາເປັນ.Reverse transcription ຈະຖືກນໍາສະເຫນີຈາກການຄັດເລືອກ reverse transcriptase ແລະ primer:

ການເລືອກການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບ:

ການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັນແບບປົກກະຕິລວມມີ AMV RTase ແລະ MMLV RTase.RNase H ຂອງ AMV RTase ມີກິດຈະກໍາທີ່ເຂັ້ມແຂງ, ຄວາມຍາວສັງເຄາະສັ້ນ, ຈໍານວນການສັງເຄາະຕ່ໍາແລະຄວາມຫມັ້ນຄົງຄວາມຮ້ອນທີ່ດີ (42 ~ 55 ℃).ກິດຈະກໍາ RNase H ຂອງ MMLV RTase ແມ່ນອ່ອນແອ, ຄວາມຍາວຂອງການສັງເຄາະແມ່ນຍາວ, ປະລິມານການສັງເຄາະແມ່ນສູງ, ແລະຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງຄວາມຮ້ອນແມ່ນບໍ່ດີ (37 ~ 42 ℃).

ເນື່ອງຈາກວ່າ RNase H enzyme ມີຫນ້າທີ່ຂອງການເສື່ອມສະພາບຂອງແມ່ແບບ RNA, MMLV ທີ່ມີກິດຈະກໍາ RNase H ທີ່ອ່ອນແອຄວນໄດ້ຮັບການຄັດເລືອກເປັນພິເສດໃນລະຫວ່າງການຖ່າຍທອດແບບປີ້ນກັບກັນ, ແລະຫຼັງຈາກວິສະວະກໍາພັນທຸກໍາຕໍ່ມາ, ຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງຄວາມຮ້ອນຂອງ MMLV ໄດ້ບັນລຸການກ້າວກະໂດດດ້ານຄຸນນະພາບ.ກິນ ForegeneForeasy Reverse Transcriptase(M-MLV ສຳລັບການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບ) ເປັນຕົວຢ່າງ, ມັນເປັນ transcriptase ປີ້ນກັບກັນໃຫມ່ສະແດງອອກໃນເຊື້ອແບັກທີເຣັຍວິສະວະກໍາ E. coli ໂດຍໃຊ້ເຕັກໂນໂລຢີການປະສົມພັນທຸກໍາ.ມັນ​ເປັນ DNA polymerase ທີ່​ປະສົມ​ເຂົ້າກັນ​ທີ່​ສັງເຄາະ​ສາຍ DNA ທີ່​ສົມ​ບູນ​ແບບ​ຈາກ RNA ສາຍ​ດຽວ, DNA, ຫຼື RNA: DNA ປະສົມ.ມັນບໍ່ມີກິດຈະກໍາ RNase H, ຄວາມຫມັ້ນຄົງທີ່ເຂັ້ມແຂງ, ຄວາມໃກ້ຊິດຂອງ RNA ທີ່ເຂັ້ມແຂງ, ແລະຄວາມອ່ອນໄຫວໃນການກວດສອບສູງ.

 

Foreasy Reverse Transcriptase(M-MLV ສຳລັບການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບ)

ການ​ຄັດ​ເລືອກ primer​:

ໂດຍທົ່ວໄປແລ້ວ primers RT ຕົກຢູ່ໃນສາມປະເພດ: oligo dT, primers ແບບສຸ່ມ, ແລະ primers ສະເພາະຂອງ gene.ເລືອກ primers ທີ່ເຫມາະສົມສໍາລັບການນໍາໃຊ້ຕາມຄວາມຕ້ອງການທົດລອງທີ່ແຕກຕ່າງກັນ.

1. ຖ້າແມ່ແບບມີຕົ້ນກໍາເນີດ eukaryotic ແລະ cDNA ທ້າຍຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການຂະຫຍາຍ PCR ປົກກະຕິ, Oligo (dT) ແມ່ນແນະນໍາ;ຖ້າການທົດລອງຕໍ່ມາຖືກນໍາໃຊ້ພຽງແຕ່ສໍາລັບ qPCR, Oligo (dT) ໄດ້ຖືກແນະນໍາໃຫ້ປະສົມກັບ primers ແບບສຸ່ມເພື່ອປັບປຸງປະສິດທິພາບຂອງ reverse transcription.

2. ຖ້າແມ່ແບບມາຈາກ prokaryotes, Random Primers ຫຼື gene specific primers ຄວນຖືກເລືອກສຳລັບການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນ.

Ⅲ.qPCR

ປະລິມານ fluorescence ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນໄດ້ຖືກອະທິບາຍຢ່າງລະອຽດຈາກການເລືອກວິທີການປະລິມານ, ຫຼັກການການອອກແບບ primer, ການຄັດເລືອກ ROX, ການຕັ້ງຄ່າລະບົບຕິກິຣິຍາແລະການຕັ້ງຄ່າເງື່ອນໄຂຂອງປະຕິກິລິຍາ, ແລະອື່ນໆ.

ການ​ຄັດ​ເລືອກ​ວິ​ທີ​ການ​ປະ​ລິ​ມານ​:

ວິ​ທີ​ການ​ປະ​ລິ​ມານ​ແບ່ງ​ອອກ​ເປັນ​ວິ​ທີ​ການ​ປະ​ລິ​ມານ​ພີ່​ນ້ອງ​ແລະ​ວິ​ທີ​ການ​ປະ​ລິ​ມານ​ຢ່າງ​ແທ້​ຈິງ​.ປະລິມານທີ່ກ່ຽວຂ້ອງສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກວດຫາຜົນກະທົບຂອງວິທີການປິ່ນປົວບາງຢ່າງກ່ຽວກັບການສະແດງອອກຂອງ gene, ກວດພົບຄວາມແຕກຕ່າງຂອງການສະແດງອອກຂອງ gene ໃນເວລາທີ່ແຕກຕ່າງກັນແລະປຽບທຽບຄວາມແຕກຕ່າງຂອງການສະແດງອອກຂອງ gene ໃນເນື້ອເຍື່ອຕ່າງໆ.ປະລິມານຢ່າງແທ້ຈິງສາມາດກວດພົບປະລິມານຂອງອາຊິດ nucleic ໃນເຊື້ອໄວຣັສແລະອື່ນໆ.ໃນ​ເວ​ລາ​ທີ່​ເຮັດ​ການ​ທົດ​ລອງ​, ພວກ​ເຮົາ​ຕ້ອງ​ເລືອກ​ເອົາ​ວິ​ທີ​ການ​ປະ​ລິ​ມານ​ທີ່​ເຫມາະ​ສົມ​ຕາມ​ການ​ທົດ​ລອງ​ຂອງ​ຕົນ​ເອງ​.

ຫຼັກ​ການ​ອອກ​ແບບ Primer​:

ການອອກແບບ primer ສໍາລັບ qPCR ແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງໂດຍກົງກັບປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍແລະຄວາມສະເພາະຂອງຜະລິດຕະພັນ.ດັ່ງນັ້ນ, ການອອກແບບ primers ທີ່ດີຢ່າງຖືກຕ້ອງແມ່ນຂັ້ນຕອນທໍາອິດຂອງ qPCR ສົບຜົນສໍາເລັດ.ໃນການອອກແບບ primer, ຫຼັກການຕໍ່ໄປນີ້ຄວນເອົາໃຈໃສ່ເມື່ອປະຕິບັດຕາມຫຼັກການຂອງການອອກແບບ primer ແບບດັ້ງເດີມ:

1. ຄວາມຍາວຂອງຊິ້ນສ່ວນເປົ້າຫມາຍຖືກຄວບຄຸມລະຫວ່າງ 100 ແລະ 300 bp;

2. ການອອກແບບ Cross-exon ເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການອິດທິພົນຂອງ DNA genomic;

3. primers ທີ່ໄດ້ຮັບການອອກແບບຕ້ອງໄດ້ຮັບການທົດສອບປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍ, ແລະພຽງແຕ່ໃນເວລາທີ່ປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍໄດ້ບັນລຸມາດຕະຖານ (90-110%) ເຂົາເຈົ້າສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການທົດລອງປະລິມານ;

4. ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ primer ປົກກະຕິແລ້ວແມ່ນ optimized ລະຫວ່າງ 0.1uM ແລະ 1.0uM.

ການຄັດເລືອກຂອງROX:

ໃນຂະບວນການປະຕິກິລິຢາປະລິມານ, ROX ສາມາດປັບຄວາມແຕກຕ່າງຂອງເສັ້ນທາງ optical, ຄວາມຜິດພາດຂອງທໍ່ຫຼືຄວາມແຕກຕ່າງກັນຂອງປະລິມານທີ່ເກີດຈາກການລະເຫີຍແລະການຂົ້ນທີ່ເປັນເອກະພາບ, ປັບປຸງຄວາມຊ້ໍາກັນຂອງຜົນໄດ້ຮັບ.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ຄວນສັງເກດວ່າການເລືອກ ROX ແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງກັບເຄື່ອງມື.ຖ້າເຄື່ອງມື qPCR ມີຫນ້າທີ່ອັດຕະໂນມັດການແກ້ໄຂຄວາມແຕກຕ່າງລະຫວ່າງຮູ, ມັນບໍ່ຈໍາເປັນຕ້ອງເພີ່ມ ROX;ຖ້າບໍ່ດັ່ງນັ້ນ, ມັນຈໍາເປັນຕ້ອງເພີ່ມການແກ້ໄຂ ROX.ຄູ່ຮ່ວມງານຂະຫນາດນ້ອຍໃນການຊື້ reagents ຈະຕ້ອງເປັນໄປຕາມເຄື່ອງມືທີ່ໃຊ້ໃນການເລືອກ ROX ທີ່ຖືກຕ້ອງ, ຫຼີກເວັ້ນການຜິດພາດຕໍ່ມາ.

ການ​ກະ​ກຽມ​ລະ​ບົບ​ຕິ​ກິ​ຣິ​ຍາ​:

ປະລິມານປະຕິກິລິຍາຂອງ 20ul ແລະ 50ul ແມ່ນມັກ.ເລື່ອງຕໍ່ໄປນີ້ຄວນເອົາໃຈໃສ່ເມື່ອລະບົບຖືກສ້າງຂື້ນ:

1. ລະບົບຕິກິຣິຍາຕ້ອງໄດ້ຮັບການກະກຽມໂດຍການລະບາຍອາກາດໃນບ່ອນເຮັດວຽກທີ່ສະອາດທີ່ສຸດ, ddH ໃຫມ່₂O ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບແຕ່ລະການທົດລອງ;

2. ແຕ່ລະການທົດລອງຕ້ອງໄດ້ກະກຽມ NTC ເພື່ອກວດສອບວ່າມີມົນລະພິດໃນລະບົບ, ແລະທຸກຄູ່ຂອງ primers ຕ້ອງເຮັດ NTC ໃນເວລາທີ່ກະກຽມລະບົບ;

3. ເພື່ອກວດພົບວ່າມີ gDNA ຕົກຄ້າງຢູ່ໃນແມ່ແບບ RNA, NRT ສາມາດກະກຽມສໍາລັບແຕ່ລະຕົວຢ່າງເພື່ອກວດຫາ;

4. ເມື່ອກະກຽມລະບົບ, ແນະນໍາໃຫ້ເຮັດຢ່າງຫນ້ອຍ 3 ຊ້ໍາຊ້ອນດ້ານວິຊາການສໍາລັບຫນຶ່ງຕົວຢ່າງ;

5. ເມື່ອແມ່ແບບແມ່ນ cDNA, ແນະນໍາໃຫ້ເຈືອຈາງ 5-10 ເທື່ອເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນຜົນກະທົບ inhibition ຂອງລະບົບ reverse transcription ໃນການທົດລອງ qPCR.ມັນດີກວ່າທີ່ຈະຂຸດຄົ້ນປະລິມານແມ່ແບບໂດຍ gradient, ດັ່ງນັ້ນຄ່າ CT ຫຼຸດລົງລະຫວ່າງ 20-30;

6. ກໍານົດຈໍານວນປະຕິກິລິຍາທີ່ຕ້ອງການ, ເພີ່ມຂຶ້ນ 5-10% ບົນພື້ນຖານຂອງຈໍານວນປະຕິກິລິຍາ, ແລະຄິດໄລ່ຕົວເລກການຕັ້ງຄ່າປະລິມານ;

7, ລະບົບໄດ້ຖືກກະກຽມໂດຍນໍາໃຊ້ຫຼັກການ premix, ປະສົມຫຼັງຈາກ centrifugation ແລະຮັບປະກັນບໍ່ມີຟອງ;

8, ເທົ່າທີ່ເປັນໄປໄດ້ທີ່ຈະເລືອກເອົາເຄື່ອງບໍລິໂພກທີ່ສະຫນັບສະຫນູນ.

ຊຸດ RT-qPCR ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ