RT-qPCR ແມ່ນການທົດລອງພື້ນຖານຂອງຊີວະວິທະຍາໂມເລກຸນ, ແລະທຸກຄົນຕ້ອງຄຸ້ນເຄີຍກັບມັນ.ມັນສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນປະກອບມີສາມຂັ້ນຕອນ: ການສະກັດເອົາ RNA, ການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບ cDNA, ແລະ PCR ປະລິມານ fluorescent ໃນເວລາຈິງ.ມັນບໍ່ໄດ້ຊ່ວຍ, ແມ່ນຫຍັງເກີດຂຶ້ນ?ມັນເປັນໄປໄດ້ວ່າມີບັນຫາກັບການທົດລອງການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນ!ເຖິງແມ່ນວ່າມັນເບິ່ງຄືວ່າການທົດລອງ reverse transcription ພຽງແຕ່ຕ້ອງການເພີ່ມ RNA, dNTP, primers, ແລະreverse transcriptaseກັບທໍ່ centrifuge ແລະປົນກັນດີ, ແຕ່ໃນຂະບວນການປະຕິບັດຕົວຈິງ, ຍັງມີລາຍລະອຽດຫຼາຍຢ່າງທີ່ຕ້ອງເອົາໃຈໃສ່.ມາຮຽນຮູ້ກ່ຽວກັບມັນ!

ວິທີການຕັດສິນຄຸນນະພາບຂອງ RNA?
ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຮັບ cDNA, ຄຸນນະພາບຂອງ RNA ແມ່ນສໍາຄັນ!ຄຸນນະພາບ RNA ສາມາດກວດພົບສ່ວນໃຫຍ່ຈາກສອງດ້ານ:
(1) ຄວາມສົມບູນຂອງ RNA:ຄວາມສົມບູນຂອງ RNA ສາມາດກວດສອບໄດ້ໂດຍ electrophoresis gel agarose. ເອົາ eukaryotes ເປັນຕົວຢ່າງ, RNA ທັງຫມົດສົມບູນມີສາມແຖບທີ່ຊັດເຈນ, ນ້ໍາຫນັກໂມເລກຸນຈາກຂະຫນາດໃຫຍ່ໄປຫາຂະຫນາດນ້ອຍແມ່ນ 28S, 18S, ແລະ 5S, ແລະ 28S ແມ່ນສອງເທົ່າຂອງ 18S;ຖ້າສາມແຖບສາມາດເຫັນໄດ້, ແຕ່ປະເພດແຖບແມ່ນມົວຫຼືການແຜ່ກະຈາຍຫມາຍຄວາມວ່າ RNA ຖືກທໍາລາຍບາງສ່ວນ.ໃນເວລານີ້, ກະລຸນາປະຕິບັດປະຕິກິລິຍາການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບທັນທີແລະເພີ່ມການປ້ອນຂໍ້ມູນແບບຢ່າງທີ່ເຫມາະສົມ;ຖ້າພຽງແຕ່ແຖບທີ່ມີນ້ໍາຫນັກໂມເລກຸນຂະຫນາດນ້ອຍຫຼືບໍ່ມີແຖບສາມາດເຫັນໄດ້, RNA ໄດ້ຖືກຊຸດໂຊມຫມົດແລ້ວແລະຕ້ອງໄດ້ຮັບການສະກັດຄືນໃຫມ່.Agilent 2100 ຊີ້ບອກເຖິງຄວາມສົມບູນຂອງ RNA ດ້ວຍແຜນວາດສູງສຸດ ແລະຄ່າ RIN.ຖ້າອາຊິດ nucleic ແມ່ນ intact, ພື້ນຖານຂອງ electropherogram ແມ່ນຮາບພຽງ;ຖ້າອາຊິດນິວຄລີອິກຖືກທໍາລາຍຢ່າງຮ້າຍແຮງ, ເສັ້ນພື້ນຖານແມ່ນບໍ່ສະເຫມີພາບແລະຈຸດສູງສຸດຂອງການຍ່ອຍສະຫຼາຍຈະປາກົດ;ຄ່າຂອງ RIN ສະທ້ອນເຖິງຄວາມສົມບູນຂອງ RNA, ພາຍໃນຂອບເຂດ 0-10, ມູນຄ່າທີ່ໃຫຍ່ກວ່າ, ຄຸນນະພາບຂອງ RNA ດີກວ່າ.ດີ, ລະດັບຄວາມສົມບູນສູງກວ່າ.
(2) ຄວາມບໍລິສຸດຂອງ RNA:ອັດ​ຕາ​ສ່ວນ​ຂອງ OD260/280 ສາ​ມາດ​ກວດ​ພົບ​ໂດຍ UV spectrophotometry .ຖ້າອັດຕາສ່ວນຂອງ OD260/280 ຢູ່ລະຫວ່າງ 1.9 ແລະ 2.1, ຄວາມບໍລິສຸດແມ່ນດີຫຼາຍ.
DNA genomic ທີ່ຕົກຄ້າງສາມາດນໍາໄປສູ່ຜົນໄດ້ຮັບໃນປະລິມານທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ
ເມື່ອ RNA ຖືກສະກັດ, RNA ທີ່ພວກເຮົາໄດ້ຮັບອາດຈະປະສົມກັບ DNA ພັນທຸ ກຳ (gDNA) ທີ່ບໍ່ໄດ້ຖືກອະນາໄມ.ດັ່ງນັ້ນ, cDNA ຫຼັງຈາກການຖອດຖອນຄືນໃຫມ່ຈະຖືກປະສົມກັບgDNA.ໃນລະຫວ່າງທາງລຸ່ມqPCRຕິ​ກິ​ຣິ​ຍາ​,cDNAແລະ gDNA ອາດຈະຖືກຂະຫຍາຍໄປພ້ອມໆກັນ, ເຮັດໃຫ້ຄ່າ CT ຂ້ອນຂ້າງນ້ອຍ, ດັ່ງນັ້ນຜົນໄດ້ຮັບອາດຈະມີຄວາມລໍາອຽງ.
ດັ່ງນັ້ນພວກເຮົາຄວນເຮັດແນວໃດໃນສະຖານະການນີ້?Foregeneແນະນຳ:
(1) ປະຕິບັດການທໍາຄວາມສະອາດ genome ໃນ RNA ປີ້ນກັບກັນ, ເຊິ່ງສາມາດຖືກໂຍກຍ້າຍອອກໂດຍການສະກັດຖັນໃນລະຫວ່າງການສະກັດເອົາ RNA;
(2) ປິ່ນປົວ RNA ທີ່ສະກັດດ້ວຍ DNAI , ແຕ່ຢຸດມັນດ້ວຍ EDTA;
ຂອງ reagents ການຖອດຂໍ້ຄວາມກັບໂມດູນການເກັບກູ້ genome ;

ວິທີການເລືອກ primers ສໍາລັບ reverse transcription?
primers ການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນຍັງມີຜົນກະທົບຕໍ່ຜົນໄດ້ຮັບຂອງປະຕິກິລິຍາການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນ.ທ່ານສາມາດເລືອກ primers ແບບສຸ່ມ, Oligo dT ຫຼື primers ສະເພາະຂອງ gene ສໍາລັບການຖອດຂໍ້ຄວາມຍ້ອນກັບຕາມສະຖານະການສະເພາະຂອງການທົດລອງ:
(1) ການຖອດຂໍ້ຄວາມສະເພາະ: primers ສະເພາະພັນທຸກໍາແມ່ນແນະນໍາ;
(2) ການຖອດຂໍ້ຄວາມຈາກຊິ້ນສ່ວນຍາວ: Oligo dT/gene-specific primers ແມ່ນແນະນໍາ;
(3) ຊິ້ນສ່ວນພາຍໃນຂອງບົດບັນທຶກສ່ວນຍາວ: primers gene-specific/ primers random / random primers + Oligo dT.ຖ້າການທົດລອງ qPCR ຕໍ່ມາໄດ້ຖືກປະຕິບັດ, Oligo dT ບໍ່ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງດຽວ, ເພາະວ່າການໃຊ້ Oligo dT ຢ່າງດຽວອາດຈະເຮັດໃຫ້ເກີດຄວາມລໍາອຽງຂອງ 3′, ເຮັດໃຫ້ຜົນການທົດລອງ qPCR ບໍ່ຖືກຕ້ອງ;
(4) miRNA: ສາມາດໃຊ້ primers ລໍາຕົ້ນ ຫຼື tailing primers.

ຜະລິດຕະພັນການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບ cDNA ຄວນເຈືອຈາງເປັນປະລິມານເທົ່າໃດ?
ຫຼັງຈາກໄດ້ຮັບ cDNA ຂອງຜະລິດຕະພັນການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນ, ຈໍານວນຄັ້ງ cDNA ຄວນຖືກເຈືອຈາງສໍາລັບການທົດລອງ qPCR ແມ່ນມີຄວາມສໍາຄັນຫຼາຍ.ຖ້າຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ cDNA ສູງເກີນໄປຫຼືຕໍ່າເກີນໄປ, ປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍອາດຈະໄດ້ຮັບຜົນກະທົບ.ສາມາດວັດແທກຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ cDNA ໄດ້, ແລະຄວນເຮັດແນວໃດ?
(1) ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ cDNA ຂອງຜະລິດຕະພັນການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນບໍ່ສາມາດວັດແທກໄດ້, ເພາະວ່ານອກຈາກຜະລິດຕະພັນ cDNA, ຜະລິດຕະພັນການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນຍັງປະກອບດ້ວຍ Buffer residual transcription, reverse transcriptase, primers, ແລະອື່ນໆ, ເຊິ່ງຈະລົບກວນຜົນການວັດແທກຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນແລະເຮັດໃຫ້ OD260/280, OD260/ 230 ປົກກະຕິຂອງ CNA.ໃນເວລານີ້, ຫມູ່ເພື່ອນບາງຄົນຈະເວົ້າວ່າ, ຫຼັງຈາກນັ້ນຂ້າພະເຈົ້າຈະວັດແທກຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຫຼັງຈາກການຊໍາລະລ້າງ;ທີ່ນີ້, Foregene ຕ້ອງການເຕືອນວ່າ cDNA ບໍ່ໄດ້ຖືກແນະນໍາໃຫ້ຖືກຊໍາລະ, ເພາະວ່າຄວາມຍາວຂອງ cDNA ທີ່ໄດ້ຮັບຈາກການຖອນຄືນແມ່ນແຕກຕ່າງກັນ, ແລະ cDNA ສັ້ນຈະສູນເສຍໃນການຊໍາລະລ້າງ.
(2) ດັ່ງນັ້ນຈະເຮັດແນວໃດ?ກ່ອນການທົດລອງ qPCR, gradient dilution ຂອງ cDNA ສາມາດຖືກກໍານົດໂດຍຜ່ານການທົດລອງກ່ອນ.ຕົວຢ່າງ: ໃຊ້ cDNA stock solution, 10-fold dilution, and 100-fold dilution as templates for qPCR experiment, and select the dilution factor with a CT value in range of 18-28.

miRNAs ຄວນຖືກຖອດຂໍ້ຄວາມແບບກົງກັນຂ້າມແນວໃດ?
miRNA ແມ່ນ RNA ໂມເລກຸນຂະຫນາດນ້ອຍສາຍດຽວທີ່ມີຂະຫນາດປະມານ 22 nt ທີ່ບໍ່ມີລະຫັດສໍາລັບທາດໂປຼຕີນ.ເນື່ອງຈາກຄວາມຍາວສັ້ນຂອງມັນ, ວິທີການ qPCR ທໍາມະດາແມ່ນຍາກທີ່ຈະກໍານົດປະລິມານໂດຍກົງ, ດັ່ງນັ້ນມັນມັກຈະມີຄວາມຈໍາເປັນທີ່ຈະຂະຫຍາຍ miRNA;ວິທີການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນທີ່ໃຊ້ທົ່ວໄປສໍາລັບ miRNA ປະກອບມີວິທີການ stem-loop ແລະວິທີການຫາງ.
ວິທີການ stem-loop ແມ່ນການຂະຫຍາຍ miRNA ໂດຍການເພີ່ມ primers stem-loop.ວິທີການກວດຫານີ້ມີຄວາມອ່ອນໄຫວ ແລະຄວາມສະເພາະທີ່ສູງກວ່າ, ແຕ່ການສົ່ງຜ່ານການກວດຫາແມ່ນຕໍ່າ.ການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນຄືນໜຶ່ງສາມາດກວດພົບໄດ້ພຽງແຕ່ໜຶ່ງ miRNA ແລະການອ້າງອີງພາຍໃນ;ວິທີການເພີ່ມຫາງແມ່ນປະກອບດ້ວຍສອງອັນ ມັນແມ່ນສໍາເລັດໂດຍການດໍາເນີນການຮ່ວມກັນຂອງສອງ enzymes, ເຊິ່ງແມ່ນ PolyA polymerase ແລະ reverse transcriptase.PolyA polymerase ແມ່ນຮັບຜິດຊອບສໍາລັບການເພີ່ມຫາງ PolyA ກັບ miRNA ເພື່ອເພີ່ມຄວາມຍາວຂອງມັນ, ແລະ reverse transcriptase ປະຕິບັດປະຕິກິລິຢາ reverse transcription.ວິທີການນີ້ມີຂໍ້ມູນຜ່ານການກວດສອບສູງແລະສາມາດກວດພົບຫຼາຍ miRNAs ແລະການອ້າງອີງພາຍໃນໃນຫນຶ່ງ reverse transcription, ແຕ່ຄວາມອ່ອນໄຫວແລະຄວາມສະເພາະແມ່ນຕໍ່າໃນວິທີການ stem-loop.