PCR ໃນເວລາຈິງ, ເຊິ່ງເອີ້ນກັນວ່າ PCR ປະລິມານຫຼື qPCR, ແມ່ນວິທີການສໍາລັບການຕິດຕາມເວລາທີ່ແທ້ຈິງແລະການວິເຄາະຜະລິດຕະພັນຂະຫຍາຍ PCR.
ເນື່ອງຈາກວ່າ PCR ປະລິມານມີຄວາມໄດ້ປຽບຂອງການດໍາເນີນງານງ່າຍດາຍ, ໄວແລະສະດວກ, ຄວາມອ່ອນໄຫວສູງ, ການເຮັດເລື້ມຄືນທີ່ດີ, ແລະອັດຕາການປົນເປື້ອນຕ່ໍາ, ມັນຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງໃນການທົດສອບທາງການແພດ, ການປະເມີນປະສິດທິພາບຢາ, ການຄົ້ນຄວ້າການສະແດງອອກຂອງ gene, ການຄົ້ນຄວ້າ transgenic, ການກວດຫາເຊື້ອພະຍາດ, ການກວດຫາເຊື້ອພະຍາດ, ການກວດຫາສັດແລະພືດ., ການທົດສອບອາຫານແລະຂົງເຂດອື່ນໆ.
ດັ່ງນັ້ນ, ບໍ່ວ່າທ່ານຈະມີສ່ວນຮ່ວມໃນການຄົ້ນຄວ້າພື້ນຖານວິທະຍາສາດຊີວິດ, ຫຼືພະນັກງານຂອງບໍລິສັດການຢາ, ບໍລິສັດລ້ຽງສັດ, ບໍລິສັດອາຫານ, ຫຼືແມ້ກະທັ້ງພະນັກງານຂອງຫ້ອງການກວດກາເຂົ້າ-ອອກແລະກັກກັນ, ພະແນກຕິດຕາມກວດກາສິ່ງແວດລ້ອມ, ໂຮງຫມໍແລະຫນ່ວຍງານອື່ນໆ, ທ່ານຈະໄດ້ສໍາຜັດຫຼາຍຫຼືຫນ້ອຍຫຼືທ່ານຈໍາເປັນຕ້ອງຮູ້ຄວາມຮູ້ຂອງ mastering PCR ປະລິມານ.

ຫຼັກການຂອງ PCR ເວລາຈິງ

Real Time PCR ແມ່ນວິທີການທີ່ສານ fluorescent ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໃນລະບົບປະຕິກິລິຢາ PCR, ແລະຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງສັນຍານ fluorescence ໃນຂະບວນການປະຕິກິລິຍາ PCR ແມ່ນຖືກຕິດຕາມໃນເວລາທີ່ແທ້ຈິງໂດຍເຄື່ອງມື PCR ປະລິມານ, ແລະສຸດທ້າຍຂໍ້ມູນການທົດລອງໄດ້ຖືກວິເຄາະແລະປຸງແຕ່ງ.

【ເສັ້ນໂຄ້ງການຂະຫຍາຍ】ແມ່ນເສັ້ນໂຄ້ງທີ່ອະທິບາຍເຖິງຂະບວນການເຄື່ອນໄຫວຂອງ PCR.ເສັ້ນໂຄ້ງຂະຫຍາຍໃຫຍ່ຂື້ນຂອງ PCR ບໍ່ແມ່ນເສັ້ນໂຄ້ງ exponential ມາດຕະຖານ, ແຕ່ເປັນເສັ້ນໂຄ້ງ sigmoid.

[ເວທີການຂະຫຍາຍເສັ້ນໂຄ້ງ]ດ້ວຍການເພີ່ມຂື້ນຂອງຈໍານວນຂອງວົງຈອນ PCR, ການ inactivation ຂອງ DNA polymerase, ການ depletion ຂອງ dNTPs ແລະ primers, ແລະການຍັບຍັ້ງຂອງຕິກິຣິຍາສັງເຄາະໂດຍການຕິກິຣິຍາ by-product pyrophosphate, ແລະອື່ນໆ, PCR ບໍ່ໄດ້ຂະຫຍາຍອອກສະເຫມີ., ແລະໃນທີ່ສຸດກໍຈະເຂົ້າສູ່ພູພຽງ.

[ພາກພື້ນການຂະຫຍາຍຕົວຂອງເສັ້ນໂຄ້ງຂະຫຍາຍໃຫຍ່ຂື້ນ]ເຖິງແມ່ນວ່າໄລຍະພູພຽງຈະແຕກຕ່າງກັນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ, ໃນພາກພື້ນສະເພາະໃດຫນຶ່ງຂອງພາກພື້ນການຂະຫຍາຍຕົວ exponential ຂອງເສັ້ນໂຄ້ງການຂະຫຍາຍ, ການ repeatability ແມ່ນດີຫຼາຍ, ເຊິ່ງເປັນສິ່ງສໍາຄັນຫຼາຍສໍາລັບການວິເຄາະປະລິມານຂອງ PCR.

[ຄ່າເກນ ແລະ ຄ່າ Ct]ພວກເຮົາກໍານົດຄ່າຈໍາກັດຂອງການກວດສອບ fluorescence ໃນຕໍາແຫນ່ງທີ່ເຫມາະສົມໃນພື້ນທີ່ການຂະຫຍາຍຕົວຂອງເສັ້ນໂຄ້ງຂະຫຍາຍໃຫຍ່ຂື້ນ, ຄືຄ່າເກນ (Threshold).ຈຸດຕັດຂອງຄ່າ threshold ແລະເສັ້ນໂຄ້ງ amplification ແມ່ນຄ່າ Ct, ນັ້ນແມ່ນ, ຄ່າ Ct ຫມາຍເຖິງຈໍານວນຮອບວຽນ (Threshold Cycle) ເມື່ອເຖິງມູນຄ່າ threshold.

ເສັ້ນສະແດງຂ້າງລຸ່ມນີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມສຳພັນລະຫວ່າງເສັ້ນເກນ ແລະເສັ້ນໂຄ້ງການຂະຫຍາຍ, ເກນ ແລະຄ່າ Ct ຢ່າງຊັດເຈນ.

【ວິທີການຈໍານວນ?】

ມັນໄດ້ຖືກພິສູດໂດຍທິດສະດີຄະນິດສາດວ່າຄ່າ Ct ມີຄວາມສໍາພັນເສັ້ນປີ້ນກັບຄ່າຂອງ logarithm ຂອງຈໍານວນແມ່ແບບເບື້ອງຕົ້ນ.PCR ໃນເວລາຈິງຕິດຕາມຜະລິດຕະພັນການຂະຫຍາຍ PCR ໃນເວລາທີ່ແທ້ຈິງແລະປະລິມານພວກມັນໃນລະຫວ່າງໄລຍະການຂະຫຍາຍຕົວເລກ.

ສໍາລັບແຕ່ລະວົງຈອນຂອງ PCR, DNA ເພີ່ມຂຶ້ນເປັນ 2 ເທົ່າ, ແລະທັນທີທັນໃດໄດ້ເຂົ້າໄປໃນພູພຽງ.

ສົມມຸດວ່າຈໍານວນ DNA ເລີ່ມຕົ້ນແມ່ນ A₀ , ຫຼັງຈາກຮອບວຽນ n, ປະລິມານທາງທິດສະດີຂອງຜະລິດຕະພັນ DNA ສາມາດສະແດງອອກເປັນ:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຈໍານວນ DNA ເບື້ອງຕົ້ນ A 0 ຫຼາຍເທົ່າໃດ, ປະລິມານຂອງຜະລິດຕະພັນຂະຫຍາຍໃຫຍ່ຂື້ນໄວເຖິງມູນຄ່າການກວດພົບ An, ແລະຈໍານວນຮອບວຽນເມື່ອເຖິງ An ແມ່ນຄ່າ Ct.ນັ້ນແມ່ນ, ຈໍານວນ DNA ເບື້ອງຕົ້ນ A 0 ຫຼາຍເທົ່າໃດ, ເສັ້ນໂຄ້ງຂະຫຍາຍໃຫຍ່ຂື້ນກ່ອນຫນ້ານັ້ນ, ແລະຈໍານວນຮອບວຽນທີ່ຕ້ອງການ n ແມ່ນນ້ອຍລົງ.

ພວກເຮົາດໍາເນີນການ gradient dilution ຂອງມາດຕະຖານຂອງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນທີ່ຮູ້ຈັກແລະນໍາໃຊ້ມັນເປັນແມ່ແບບສໍາລັບ PCR ທີ່ແທ້ຈິງ, ແລະຊຸດຂອງເສັ້ນໂຄ້ງການຂະຫຍາຍຈະໄດ້ຮັບໃນໄລຍະເທົ່າທຽມກັນໃນຄໍາສັ່ງຂອງການເລີ່ມຕົ້ນຈໍານວນ DNA ຈາກຫຼາຍຫາຫນ້ອຍ.ອີງຕາມຄວາມສໍາພັນເສັ້ນຊື່ລະຫວ່າງຄ່າ Ct ແລະ logarithm ຂອງຈໍານວນແມ່ແບບເລີ່ມຕົ້ນ, a[ເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານ] ສາມາດສ້າງໄດ້ .

ໂດຍການທົດແທນຄ່າ Ct ຂອງຕົວຢ່າງທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທີ່ບໍ່ຮູ້ຈັກເຂົ້າໄປໃນເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານ, ຈໍານວນແມ່ແບບເບື້ອງຕົ້ນຂອງຕົວຢ່າງທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນທີ່ບໍ່ຮູ້ຈັກສາມາດໄດ້ຮັບ, ເຊິ່ງເປັນຫຼັກການປະລິມານຂອງ Real Time PCR.

ວິທີການກວດຫາ PCR ເວລາຈິງ

ເວລາຈິງ PCR ກວດພົບຜະລິດຕະພັນຂະຫຍາຍ PCR ໂດຍການກວດສອບຄວາມເຂັ້ມ fluorescence ໃນລະບົບຕິກິຣິຍາ.

ຫຼັກການຂອງວິທີການຝັງສີຍ້ອມ fluorescent】

ສີຍ້ອມ fluorescentເຊັ່ນ: TB Green ® , ສາມາດຜູກມັດຢ່າງບໍ່ສະເພາະກັບ DNA ທີ່ມີສາຍສອງໃນລະບົບ PCR ແລະ fluoresce ຕາມການຜູກມັດ.

ຄວາມເຂັ້ມຂອງ fluorescence ໃນລະບົບຕິກິຣິຍາເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍດ້ວຍການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງວົງຈອນ PCR.ໂດຍການກວດສອບຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ fluorescence, ປະລິມານການຂະຫຍາຍ DNA ໃນລະບົບຕິກິຣິຍາສາມາດຖືກກວດສອບໃນເວລາທີ່ແທ້ຈິງ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຈໍານວນແມ່ແບບເລີ່ມຕົ້ນໃນຕົວຢ່າງສາມາດຄາດຄະເນໄດ້.

【ຫຼັກການຂອງວິທີການ probe fluorescent】

ການສືບສວນ fluorescentແມ່ນລໍາດັບອາຊິດນິວຄລີອິກທີ່ມີກຸ່ມ fluorescent ຢູ່ປາຍ 5′ ແລະກຸ່ມ quenching ຢູ່ທີ່ 3′, ເຊິ່ງໂດຍສະເພາະສາມາດຜູກມັດກັບແມ່ແບບ.ໃນເວລາທີ່ probe ບໍ່ intact, fluorescence ປ່ອຍອອກມາໂດຍ fluorophore ໄດ້ quenched ໂດຍກຸ່ມ quenching ແລະບໍ່ສາມາດ fluoresce ໄດ້.ໃນເວລາທີ່ probe ໄດ້ຖືກ decomposed, ສານ fluorescent ຈະ dissociate ແລະປ່ອຍ fluorescence.

A fluorescent probe ໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໃນການແກ້ໄຂປະຕິກິລິຍາ PCR.ໃນ​ລະ​ຫວ່າງ​ການ​ຂະ​ບວນ​ການ annealing​, probe fluorescent ຈະ​ຜູກ​ມັດ​ກັບ​ຕໍາ​ແຫນ່ງ​ສະ​ເພາະ​ຂອງ​ແມ່​ແບບ​.ໃນ​ລະ​ຫວ່າງ​ຂະ​ບວນ​ການ​ຂະ​ບວນ​ການ​ຂະ​ຫຍາຍ, ກິດ​ຈະ​ກໍາ exonuclease 5′→3′ ຂອງ enzyme PCR ສາ​ມາດ decompose probe fluorescent ປະ​ສົມ​ກັບ​ແມ່​ແບບ​, ແລະ​ສານ fluorescent ແມ່ນ dissociated ເພື່ອ​ປ່ອຍ fluorescence​.ໂດຍການກວດສອບຄວາມເຂັ້ມ fluorescence ຂອງ probe ໃນລະບົບຕິກິຣິຍາ, ຈຸດປະສົງຂອງການຕິດຕາມປະລິມານການຂະຫຍາຍຂອງຜະລິດຕະພັນ PCR ສາມາດບັນລຸໄດ້.

【ການເລືອກວິທີການກວດຫາ fluorescence】

ຖ້າມັນຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອຈໍາແນກລໍາດັບທີ່ມີ homology ສູງແລະປະຕິບັດການກວດສອບ multiplex PCR ເຊັ່ນການວິເຄາະການພິມ SNP, ວິທີການ fluorescent probe ແມ່ນ irreplaceable.
ສໍາລັບການທົດລອງ PCR ໃນເວລາຈິງອື່ນໆ, ວິທີການ fluorescent chimera ງ່າຍດາຍ, ງ່າຍແລະລາຄາຖືກສາມາດນໍາໃຊ້ໄດ້.

probes ສະເພາະທີ່ເຂັ້ມແຂງ, ສາມາດ multix PCR

ຂໍ້ບົກຜ່ອງ

ຄວາມຕ້ອງການສະເພາະສູງສໍາລັບການຂະຫຍາຍ;

multiplex PCR ບໍ່ສາມາດປະຕິບັດໄດ້ຈໍາເປັນຕ້ອງອອກແບບ probes ສະເພາະ, ຄ່າໃຊ້ຈ່າຍສູງ;

ບາງຄັ້ງການອອກແບບ probe ແມ່ນມີຄວາມຫຍຸ້ງຍາກ

ຜະ​ລິດ​ຕະ​ພັນ​ທີ່​ກ່ຽວ​ຂ້ອງ: