ທຸກຄົນເວົ້າກ່ຽວກັບຫຼັກການຂອງການທົດລອງ qRT-PCR, ການອອກແບບ primer, ການຕີຄວາມຫມາຍຜົນໄດ້ຮັບ, ແລະອື່ນໆ, ແຕ່ຂ້ອຍຄິດວ່າຂ້ອຍຄວນແບ່ງປັນກັບເຈົ້າກ່ຽວກັບການປະຕິບັດການທົດລອງຂອງ qRT-PCR.ມັນນ້ອຍ, ແຕ່ມັນກ່ຽວກັບຜົນໄດ້ຮັບ.

ກ່ອນທີ່ຈະເຮັດ qRT-PCR, ພວກເຮົາຈໍາເປັນຕ້ອງມີຄວາມເຂົ້າໃຈຢ່າງຈະແຈ້ງກ່ຽວກັບ RNA ຂອງພວກເຮົາເອງແລະວິທີການປະຕິບັດງານ.ຫຼັງຈາກທີ່ທັງຫມົດ, ຄວາມພະຍາຍາມຂອງພວກເຮົາແມ່ນມີຈຸດປະສົງເພື່ອໃຫ້ຜົນໄດ້ຮັບ, ແທນທີ່ຈະພຽງແຕ່ປະຕິບັດ.ດັ່ງນັ້ນກ່ອນທີ່ຈະເຮັດ qRT-PCR, ພວກເຮົາຈໍາເປັນຕ້ອງກໍານົດບັນຫາຕໍ່ໄປນີ້ (ບາງອັນແມ່ນໃຊ້ກັບ SYBR ເທົ່ານັ້ນ).

1 ທ່ານແນ່ໃຈບໍ່ວ່າ RNA ຂອງທ່ານບໍ່ໄດ້ຖືກທໍາລາຍ?

NanoDrop 2000 ພຽງແຕ່ສາມາດກວດພົບຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນແລະຄວາມບໍລິສຸດຂອງ RNA, ແຕ່ບໍ່ສາມາດກວດພົບຄວາມສົມບູນຂອງ RNA.

ຄ່າ RNA (RNA Intesity Number) ສາມາດສະທ້ອນເຖິງຄວາມສົມບູນຂອງ RNA, ເຊິ່ງຖືກກວດພົບໂດຍລະບົບ Agilent 2100 Bioanalyzer.

Fig. ແຜນວາດແຜນພາບຂອງຄ່າ RIN ສໍາລັບຕົວຢ່າງ RNA ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (eukaryotes)

ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ຫ້ອງທົດລອງໂດຍທົ່ວໄປບໍ່ມີ Agilent 2100 Bioanalyzer.ໃນກໍລະນີນີ້, ພວກເຮົາສາມາດກວດພົບໄດ້ໂດຍຜ່ານ gel formaldehyde, ແຕ່ຄວາມຕ້ອງການສໍາລັບຈໍານວນ RNA ທັງຫມົດແມ່ນສູງ, ດັ່ງນັ້ນວິທີທີ່ໄວທີ່ສຸດແມ່ນການນໍາໃຊ້ gel electrophoresis ທໍາມະດາ.ມັນຈໍາເປັນຕ້ອງຢູ່ໃນສະພາບແວດລ້ອມທີ່ບໍ່ມີທາດນິວເຄລຍ, ດັ່ງນັ້ນມັນຈໍາເປັນຕ້ອງລ້າງຖັງ electrophoresis, ແກ້ວ sol, ວົງເລັບ gel ແລະ comb ດ້ວຍນ້ໍາ DEPC.agarose ຍັງບໍ່ມີນິວເຄລຍ (ຕາບໃດທີ່ມັນຖືກເປີດສົດໆ), ແລະ Loading Buffer ຄວນເປີດສົດໆຫຼາຍເທົ່າທີ່ເປັນໄປໄດ້, ດ້ວຍ 1.2%.

ໃຫ້ສັງເກດວ່າ gel ຕ້ອງໄດ້ຮັບການລະລາຍຫມົດ, ຖ້າບໍ່ດັ່ງນັ້ນມັນຈະເຮັດໃຫ້ເກີດແຖບ inhomogeneous, ດັ່ງທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຕົວຢ່າງ 9 ໃນຮູບ.ຖ້າແຮງດັນສູງເກີນໄປຫຼືແລ່ນດົນເກີນໄປຈະສ້າງຄວາມຮ້ອນແລະເຮັດໃຫ້ RNA ເຊື່ອມໂຊມ, ດັ່ງນັ້ນແຮງດັນແລະເວລາຄວນໄດ້ຮັບການຄວບຄຸມຢ່າງສົມເຫດສົມຜົນ.ນອກຈາກນັ້ນ, ການແລ່ນ gel ຍັງສາມາດກໍານົດຕື່ມອີກວ່າມີ DNA residue ໃນຕົວຢ່າງ, ແລະສັງເກດເຫັນວ່າມີແຖບເກັບຮັກສາໄວ້ຈໍານວນຫລາຍຢູ່ໃນການແຈກຢາຍດີ.

ຮູບ.ການກວດຫາ electrophoresis gel ຂອງ RNA

2 ທ່ານແນ່ໃຈບໍ່ກ່ຽວກັບຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ cDNA ຂອງທ່ານ?

ປະສົບການຂອງອ້າຍນ້ອງໃຫຍ່ໃນຫ້ອງທົດລອງແມ່ນວ່າ cDNA ຂອງລະບົບ 20 ul ທີ່ໄດ້ຮັບໂດຍແຕ່ລະ inversion ແມ່ນ diluted ໂດຍກົງ 20X, ໃນຂະນະທີ່ເອື້ອຍນ້ອງຫລັງປະລິນຍາເອກແມ່ນ diluted 10X.ຂ້ອຍມັກຈະຂຶ້ນກັບສະຖານະການ.ເນື່ອງຈາກວ່າຄຸນນະພາບຂອງ RNA ທີ່ກ່າວເຖິງໂດຍແຕ່ລະຄົນແມ່ນແຕກຕ່າງກັນ, ລະດັບການປີ້ນກັບກັນກໍ່ແຕກຕ່າງກັນ, ແລະເຕັກໂນໂລຢີການປີ້ນກັບກັນອາດຈະບໍ່ມີຄວາມຫມັ້ນຄົງ.

ດັ່ງນັ້ນທຸກໆຄັ້ງທີ່ຂ້ອຍໄດ້ຮັບ cDNA ທີ່ຖືກປະຕິເສດ, ທໍາອິດຂ້ອຍຈະເຈືອຈາງປະມານ 3 ເທື່ອ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນໃຊ້ gene ຮັກສາເຮືອນເພື່ອເຮັດ RT-PCR, ຈໍານວນຮອບວຽນໂດຍທົ່ວໄປແມ່ນ 25 ຮອບ, ເພື່ອກໍານົດຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສະເພາະ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນກໍານົດປັດໄຈການເຈືອຈາງສຸດທ້າຍ.

3 ທ່ານແນ່ໃຈບໍ່ວ່າ primers ຂອງທ່ານໃຊ້ງ່າຍ?

ມັນສາມາດຜ່ານເສັ້ນໂຄ້ງການລະລາຍຂອງ qRT-PCR, ແຕ່ນີ້ຍັງເສຍເງິນ.ສໍາລັບຫ້ອງທົດລອງທີ່ບໍ່ມີເງິນຫຼາຍ, ເມື່ອພວກເຂົາໄດ້ຮັບ primers ຫຼາຍ, ພວກເຂົາສາມາດໃຊ້ RT-PCR ທໍາມະດາເພື່ອເບິ່ງວ່າມັນເປັນແຖບດຽວແລະກໍານົດຄວາມສະເພາະຂອງ primers.ຖ້າຫ້ອງທົດລອງບໍ່ຂາດເງິນ, ຄວາມສະເພາະຂອງ primers ທັງຫມົດສາມາດຖືກກໍານົດຫນຶ່ງຄັ້ງຜ່ານເສັ້ນໂຄ້ງ melting.

4 ທ່ານແນ່ໃຈບໍ່ວ່າເງື່ອນໄຂການທົດລອງຂອງທ່ານເໝາະສົມ?

SYBR ຄວນຖືກປ້ອງກັນຈາກແສງສະຫວ່າງທີ່ແຂງແຮງ, ດັ່ງນັ້ນພະຍາຍາມປິດໄຟຢູ່ເທິງຫົວເມື່ອເພີ່ມ SYBR reagent, ແລະພຽງແຕ່ຕ້ອງໃຊ້ແສງສະຫວ່າງເລັກນ້ອຍເພື່ອໃຫ້ມັນສໍາເລັດ.

ເກັບຮັກສາ SYBR ທີ່ 4°C.ເມື່ອນຳໃຊ້, ຄ່ອຍໆປີ້ນຂຶ້ນ ແລະ ລົງເພື່ອປະສົມເຂົ້າກັນເພື່ອບໍ່ໃຫ້ເກີດຟອງ, ແລະບໍ່ຖອກເທຢ່າງແຮງ.

ນ້ອງສາວບາງຄົນມັກແຕ້ມເຄື່ອງໝາຍໃສ່ກະດານ PCR ເພາະຢ້ານວ່າຈະເອົາຕົວຢ່າງມາປົນກັນ, ເຊິ່ງມັນຜິດ.ເນື່ອງຈາກວ່າເຄື່ອງຫມາຍຂອງທ່ານມີແນວໂນ້ມທີ່ຈະສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ການເກັບກໍາສັນຍານ fluorescent, ໂດຍທົ່ວໄປແລ້ວຂ້າພະເຈົ້າແນະນໍາໃຫ້ juniors ໃຊ້ notebooks ທົດລອງເພື່ອຊ່ວຍໃນຄວາມຊົງຈໍາ, ດັ່ງທີ່ສະແດງຂ້າງລຸ່ມນີ້.

ຮູບ.ແຜນວາດການໂຫຼດຕົວຢ່າງ qRT-PCR

5 ທ່ານແນ່ໃຈບໍ່ວ່າທ່ານກໍາລັງເຮັດມັນຖືກຕ້ອງ?

ໃຫ້ແນ່ໃຈວ່າໃສ່ຖົງມື, ໃສ່ຖົງມື, ໃສ່ຖົງມື, ແລະເວົ້າສິ່ງທີ່ສໍາຄັນສາມເທື່ອ.

ເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນການເປີດເຜີຍຂອງ SYBR ກັບແສງສະຫວ່າງ, ຂ້າພະເຈົ້າສ່ວນບຸກຄົນມັກເພີ່ມແມ່ແບບທໍາອິດ, ດັ່ງທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຮູບຂ້າງລຸ່ມນີ້.ອີງຕາມປະສົບການ, ການເພີ່ມຈໍານວນເລັກນ້ອຍຂອງແມ່ແບບມີແນວໂນ້ມທີ່ຈະເຮັດໃຫ້ເກີດຄວາມຜິດພາດໃນການເກັບຕົວຢ່າງ.ດັ່ງນັ້ນ, ເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນຄວາມຜິດພາດທີ່ເກີດຈາກການເພີ່ມຈໍານວນນ້ອຍຂອງແມ່ແບບ, ຂ້ອຍມັກຈະເພີ່ມຕົວຢ່າງອີກເທື່ອຫນຶ່ງ, ແລະສອງເທົ່າເມື່ອເພີ່ມຕົວຢ່າງເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນການເພີ່ມ H2O2.

ຮູບ.ແຜນວາດແຜນວາດການໂຫຼດ qRT-PCR

ຫຼັງຈາກນັ້ນ, configure ລະບົບ qRT-PCR ດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້.

ຮູບ.ແຜນວາດການກະກຽມລະບົບ qRT-PCR

ໝາຍເຫດ: ຂັ້ນຕອນການກຳນົດຄ່າຕ້ອງເຮັດເທິງນ້ຳກ້ອນ.

ຫຼັງຈາກເພີ່ມຕົວຢ່າງ, ວາງແຜ່ນຜະນຶກທີ່ໂປ່ງໃສ.ພະຍາຍາມບໍ່ໃຫ້ແຕະພື້ນຜິວຂອງຮູບເງົາປະທັບຕາໂປ່ງໃສດ້ວຍມືຂອງທ່ານ, ພຽງແຕ່ດໍາເນີນການຈາກຊ່ອງທັງສອງດ້ານຂອງຮູບເງົາ.ເນື່ອງຈາກວ່າລາຍນິ້ວມືອາດຈະສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ການລວບລວມສັນຍານ fluorescent.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ໃຊ້ centrifuge ເພື່ອ centrifuge ຢ່າງໄວວາສໍາລັບ 10 s ດ້ວຍຄວາມໄວຕ່ໍາເພື່ອປ້ອງກັນບໍ່ໃຫ້ຕົວຢ່າງຈາກການຫ້ອຍຢູ່ເທິງກໍາແພງ.

ຜະ​ລິດ​ຕະ​ພັນ​ທີ່​ກ່ຽວ​ຂ້ອງ:

ຊຸດ Cell Direct RT-qPCR

RT ງ່າຍ II