ໂຄວິດ-19 ເປັນພະຍາດຕິດຕໍ່ທີ່ເກີດຈາກໂຣກລະບົບຫາຍໃຈສ້ວຍແຫຼມຮ້າຍແຮງ ໄວຣັສໂຄໂຣນາ ຊະນິດທີ 2. ເມື່ອຄົນເຮົາຕິດເຊື້ອ, ອາການທີ່ພົບເລື້ອຍທີ່ສຸດແມ່ນເປັນໄຂ້, ໄອ ແລະ ຫາຍໃຈບໍ່ສະດວກ.

ຕົວຢ່າງທີ່ໃຊ້ສໍາລັບການທົດສອບສາມາດເກັບໄດ້ໂດຍ swab nasopharyngeal ຫຼື swabs oropharyngeal.

PCR ແມ່ນຫຍັງ?

ວິທີການມາດຕະຖານຂອງການກວດຫາໂຣກ coronavirus ແມ່ນປະຕິກິລິຍາລະບົບຕ່ອງໂສ້ polymerase, PCR.ນີ້ແມ່ນວິທີການທີ່ໃຊ້ກັນຢ່າງກວ້າງຂວາງໃນຊີວະວິທະຍາໂມເລກຸນ.ມັນສາມາດຄັດລອກຊິ້ນສ່ວນ DNA ສະເພາະຫຼາຍລ້ານຫາພັນລ້ານໄດ້ໄວ.

ໂຣກ coronavirus ຊະນິດໃຫມ່ປະກອບດ້ວຍ RNA genome ທີ່ມີສາຍດ່ຽວຍາວຫຼາຍ.ເພື່ອກວດຫາເຊື້ອໄວຣັສເຫຼົ່ານີ້ໂດຍ PCR, ໂມເລກຸນ RNA ຕ້ອງໄດ້ຮັບການປ່ຽນເປັນລໍາດັບ DNA ເສີມຂອງເຂົາເຈົ້າໂດຍການ reverse transcriptase, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນ DNA ທີ່ສັງເຄາະໃຫມ່ສາມາດຂະຫຍາຍໄດ້ໂດຍຂັ້ນຕອນ PCR ມາດຕະຖານ, ເຊິ່ງເອີ້ນກັນທົ່ວໄປວ່າ RT-PCR.

ຂະບວນການ RT-PCR

ການສະກັດເອົາ RNA

ເພື່ອປະຕິບັດວິທີການນີ້, RNA ໄວຣັສຄວນຈະຖືກສະກັດໂດຍພື້ນຖານ.ຊຸດອະນາໄມ RNA ຫຼາກຫຼາຍຊະນິດສາມາດໃຊ້ສໍາລັບການແຍກຕົວທີ່ສະດວກ, ໄວ ແລະມີປະສິດທິພາບ.

ເພື່ອສະກັດ RNA ໄວຣັສໂດຍໃຊ້ຊຸດການຄ້າ, ທໍາອິດໃຫ້ເພີ່ມຕົວຢ່າງໃສ່ທໍ່ microcentrifuge ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນປະສົມກັບ lysis buffer.ບັຟເຟີນີ້ແມ່ນມີຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສູງແລະປົກກະຕິແລ້ວປະກອບດ້ວຍ phenol ແລະ guanidine isothiocyanate.ນອກຈາກນັ້ນ, ປົກກະຕິແລ້ວຢາຍັບຍັ້ງ RNase ແມ່ນມີຢູ່ໃນ lysis buffer ເພື່ອຮັບປະກັນການໂດດດ່ຽວຂອງ RNA ໄວຣັສທີ່ບໍ່ຄົງຕົວ.

ຫຼັງຈາກເພີ່ມ lysis buffer, vortex ທໍ່ປະສົມໂດຍກໍາມະຈອນແລະ incubate ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ເຊື້ອໄວຣັສໄດ້ຖືກ lysed ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂ denaturing ສູງທີ່ສະຫນອງໃຫ້ໂດຍ lysis buffer.

ຫຼັງຈາກຕົວຢ່າງຖືກ lysed, ທໍ່ centrifuge ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບຂັ້ນຕອນການເຮັດຄວາມສະອາດ.ຕົວຢ່າງຖືກໂຫລດເຂົ້າໄປໃນທໍ່ centrifuge ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນ centrifuged.

ຂັ້ນຕອນນີ້ແມ່ນວິທີການສະກັດເອົາໄລຍະແຂງທີ່ໄລຍະ stationary ປະກອບດ້ວຍ silica gel matrix.

ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂຂອງເກືອແລະ pH ທີ່ດີທີ່ສຸດ, ໂມເລກຸນ RNA ຜູກມັດກັບເຍື່ອຊິລິກາ.

ໃນເວລາດຽວກັນ, ທາດໂປຼຕີນແລະສານປົນເປື້ອນອື່ນໆຖືກໂຍກຍ້າຍ.

ຫຼັງຈາກການຫມູນວຽນ, ເອົາທໍ່ centrifuge ເຂົ້າໄປໃນທໍ່ເກັບມ້ຽນທີ່ສະອາດ, ຖິ້ມການກັ່ນຕອງ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຕື່ມໃສ່ຝາຊັກຜ້າ.

ວາງທໍ່ຢູ່ໃນຈຸດສູນກາງອີກເທື່ອຫນຶ່ງເພື່ອບັງຄັບໃຫ້ລ້າງ buffer ຜ່ານເຍື່ອ.ນີ້ຈະເອົາສິ່ງສົກກະປົກທີ່ຍັງເຫຼືອທັງຫມົດອອກຈາກເຍື່ອ, ປ່ອຍໃຫ້ RNA ຜູກມັດກັບ silica gel ເທົ່ານັ້ນ.

ຫຼັງຈາກລ້າງຕົວຢ່າງ, ເອົາທໍ່ເຂົ້າໄປໃນທໍ່ microcentrifuge ທີ່ສະອາດແລະເພີ່ມ elution buffer.

ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ມັນແມ່ນ centrifuged ເພື່ອບັງຄັບໃຫ້ elution buffer ຜ່ານເຍື່ອ.buffer elution ເອົາ RNA ໄວຣັສອອກຈາກຖັນ spin ແລະໄດ້ຮັບ RNA ບໍລິສຸດທີ່ບໍ່ມີທາດໂປຼຕີນ, inhibitors, ແລະສິ່ງປົນເປື້ອນອື່ນໆ.

ຂັ້ນຕອນທີ 2

ປະສົມເຂັ້ມຂຸ້ນ

ຫຼັງຈາກການສະກັດເອົາ RNA ໄວຣັສ, ຂັ້ນຕອນຕໍ່ໄປແມ່ນການກະກຽມປະສົມຕິກິຣິຍາສໍາລັບການຂະຫຍາຍ PCR.ໃນຂັ້ນຕອນນີ້, ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຖືກນໍາໃຊ້.ການແກ້ໄຂຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນນີ້ແມ່ນການແກ້ໄຂຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ premixed ປະກອບດ້ວຍ premix, reverse transcriptase, nucleotides, forward primer, reverse primer, TaqMan probe ແລະ DNA polymerase.

ສຸດທ້າຍ, ເພື່ອເຮັດສໍາເລັດການປະສົມປະຕິກິລິຢານີ້, ແມ່ແບບ RNA ຖືກເພີ່ມ.ທໍ່ໄດ້ຖືກປະສົມໂດຍການ vortexing ກໍາມະຈອນ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນປະສົມຕິກິຣິຍາໄດ້ຖືກ loaded ເຂົ້າໄປໃນແຜ່ນ PCR.ແຜ່ນ PCR ປົກກະຕິແລ້ວມີ 96 ຂຸມແລະສາມາດວິເຄາະຫຼາຍຕົວຢ່າງໃນເວລາດຽວກັນ.

ຂັ້ນຕອນທີ 3

ການຂະຫຍາຍ PCR

ຕໍ່ໄປ, ເອົາແຜ່ນໃສ່ໃນເຄື່ອງ PCR, ເຊິ່ງເປັນສິ່ງຈໍາເປັນເຄື່ອງວົງຈອນຄວາມຮ້ອນ.

RT-PCR ໃນເວລາຈິງຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກວດຫາໂຣກ coronavirus ໃຫມ່ 2019 ໂດຍການຂະຫຍາຍລໍາດັບເປົ້າຫມາຍໃນ gene RdrRP, gene E ແລະ N gene.ທາງເລືອກຂອງ gene ເປົ້າຫມາຍແມ່ນຂຶ້ນກັບລໍາດັບ primer ແລະ probe.

ຂັ້ນຕອນທໍາອິດຂອງ RT-PCR ແມ່ນການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນ.ສາຍພັນທໍາອິດຂອງ DNA ເສີມແມ່ນໄດ້ຖືກສັງເຄາະ, ເຊິ່ງລິເລີ່ມໂດຍ PCR reverse primer, ເຊິ່ງຜູກມັດກັບສ່ວນເສີມຂອງ genome RNA ໄວຣັດ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, reverse transcriptase ເພີ່ມ DNA nucleotides ໃສ່ 3′ໃນຕອນທ້າຍຂອງ primer ເພື່ອສັງເຄາະ DNA ທີ່ສົມບູນກັບ RNA ໄວຣັດ.ອຸນຫະພູມແລະໄລຍະເວລາຂອງຂັ້ນຕອນນີ້ແມ່ນຂຶ້ນກັບ primers, RNA ເປົ້າຫມາຍ, ແລະ reverse transcriptase ທີ່ໃຊ້.

ຕໍ່ໄປ, ຂັ້ນຕອນການແຍກຕົວຕົນເບື້ອງຕົ້ນແມ່ນຖືກນໍາໃຊ້, ເຊິ່ງເຮັດໃຫ້ການປະສົມພັນຂອງ RNA-DNA.ຂັ້ນຕອນນີ້ແມ່ນມີຄວາມຈໍາເປັນເພື່ອກະຕຸ້ນ DNA polymerase.ໃນເວລາດຽວກັນ, reverse transcriptase ແມ່ນ inactivated.

PCR ປະກອບດ້ວຍຊຸດຂອງວົງຈອນຄວາມຮ້ອນ.ແຕ່ລະວົງຈອນປະກອບດ້ວຍ denaturation, annealing ແລະຂັ້ນຕອນການຂະຫຍາຍ.

ຂັ້ນ​ຕອນ​ການ denaturation ແມ່ນ​ກ່ຽວ​ຂ້ອງ​ກັບ​ການ​ເຮັດ​ໃຫ້​ຄວາມ​ຮ້ອນ​ຫ້ອງ​ຕິ​ກິ​ຣິ​ຍາ​ກັບ 95 ອົງ​ສາ​ເຊນ​ເຊ​ຊ​ແລະ​ການ​ນໍາ​ໃຊ້​ມັນ​ສໍາ​ລັບ​ການ denaturation ຂອງ​ແມ່​ແບບ DNA ສອງ​ສາຍ​.

ໃນຂັ້ນຕອນຕໍ່ໄປ, ອຸນຫະພູມປະຕິກິລິຢາຖືກຫຼຸດລົງເຖິງ 58 ອົງສາເຊນຊຽດ, ອະນຸຍາດໃຫ້ primer ດ້ານຫນ້າສາມາດຫມຸນເຂົ້າໄປໃນສ່ວນເສີມຂອງແມ່ແບບ DNA ເສັ້ນດຽວຂອງມັນ.ອຸນຫະພູມ annealing ໂດຍກົງແມ່ນຂຶ້ນກັບຄວາມຍາວແລະອົງປະກອບຂອງ primer.

ໃນຂັ້ນຕອນການຂະຫຍາຍ, DNA polymerase ສັງເຄາະສາຍພັນ DNA ໃຫມ່ທີ່ສົມບູນກັບສາຍພັນແມ່ແບບ DNA.ໂດຍການເພີ່ມ nuclei ຟຣີໃຫ້ກັບແມ່ແບບໃນທິດທາງ 5′ ຫາ 3′ ຈາກປະສົມປະຕິກິລິຍາ.ອຸນຫະພູມຂອງຂັ້ນຕອນນີ້ແມ່ນຂຶ້ນກັບ DNA polymerase ທີ່ໃຊ້.

ຫຼັງຈາກຮອບວຽນທໍາອິດ, ເປົ້າຫມາຍ DNA ທີ່ມີສາຍສອງແມ່ນໄດ້ຮັບ.

ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ເຂົ້າໄປໃນວົງຈອນທີສອງ.DNA ເສັ້ນຄູ່ແມ່ນ denatured ເພື່ອຜະລິດ 2 ໂມເລກຸນ DNA ສາຍດຽວ.

ໃນຂັ້ນຕອນຕໍ່ໄປ, ອຸນຫະພູມປະຕິກິລິຢາຫຼຸດລົງ, primers ໄດ້ຖືກ annealed ກັບແຕ່ລະແມ່ແບບ DNA ສາຍດຽວ, ແລະການສືບສວນ Taq-man ແມ່ນ annealed ກັບພາກສ່ວນທີ່ສົມບູນຂອງ DNA ເປົ້າຫມາຍ.

ການສືບສວນ TaqMan ປະກອບດ້ວຍ fluorophore covalently ເຊື່ອມຕໍ່ກັບ 5′ໃນຕອນທ້າຍຂອງການສືບສວນ oligonucleotide.ໃນເວລາທີ່ຕື່ນເຕັ້ນໂດຍແຫຼ່ງແສງສະຫວ່າງຂອງ cycler, fluorophore ປ່ອຍ fluorescence.ນອກຈາກນັ້ນ, probe ແມ່ນປະກອບດ້ວຍ quencher ຢູ່ໃນ 3′ທ້າຍ.ຄວາມໃກ້ຊິດຂອງ gene ນັກຂ່າວກັບ quencher ປ້ອງກັນການກວດພົບຂອງ fluorescence.

ໃນຂັ້ນຕອນການຂະຫຍາຍ, DNA polymerase ສັງເຄາະສາຍພັນໃໝ່.ເມື່ອໂພລີເມີເຣສໄປຮອດການສືບສວນຂອງ TaqMan, ກິດຈະກໍາ 5′ນິວເຄລຍຂອງ endogenous ຂອງມັນ cleaves probe, ແຍກສີຍ້ອມອອກຈາກ quencher.

ດ້ວຍແຕ່ລະວົງຈອນຂອງ PCR, ໂມເລກຸນສີຍ້ອມຫຼາຍຈະຖືກປ່ອຍອອກມາ, ເຊິ່ງກໍ່ໃຫ້ເກີດຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ fluorescence ເພີ່ມຂຶ້ນຕາມອັດຕາສ່ວນຂອງ amplicons ທີ່ສັງເຄາະ.

ວິທີການນີ້ອະນຸຍາດໃຫ້ຄາດຄະເນຈໍານວນຂອງລໍາດັບທີ່ໃຫ້ຢູ່ໃນຕົວຢ່າງ.ຈໍານວນຂອງຊິ້ນ DNA ທີ່ມີສາຍສອງເທົ່າໃນແຕ່ລະຮອບ.ດັ່ງນັ້ນ, PCR ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອວິເຄາະຕົວຢ່າງຂະຫນາດນ້ອຍຫຼາຍ.

ສໍາລັບການວັດແທກສັນຍານ fluorescent, ໂຄມໄຟ tungsten halogen, ການກັ່ນຕອງຕື່ນເຕັ້ນ, ສະທ້ອນແສງ, ເລນ, ການກັ່ນຕອງການປ່ອຍອາຍພິດແລະການສາກໄຟອຸປະກອນສົມທົບ - ໃຊ້ກ້ອງຖ່າຍຮູບ CCD.

ຂັ້ນຕອນທີ 4 ກວດພົບ

ສໍາລັບການວັດແທກສັນຍານ fluorescent, ໂຄມໄຟ tungsten halogen, ການກັ່ນຕອງຕື່ນເຕັ້ນ, ສະທ້ອນແສງ, ເລນ, ການກັ່ນຕອງການປ່ອຍອາຍພິດແລະການສາກໄຟອຸປະກອນສົມທົບ - ໃຊ້ກ້ອງຖ່າຍຮູບ CCD.

ແສງທີ່ຖືກກັ່ນຕອງຈາກໂຄມໄຟຖືກສະທ້ອນໂດຍເຄື່ອງສະທ້ອນແສງ, ຜ່ານເລນ condenser, ແລະຖືກສຸມໃສ່ສູນກາງຂອງແຕ່ລະຮູ.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, fluorescence ທີ່ປ່ອຍອອກມາຈາກຂຸມແມ່ນສະທ້ອນໃຫ້ເຫັນຈາກກະຈົກ, ຜ່ານການກັ່ນຕອງການປ່ອຍອາຍພິດ, ແລະຖືກກວດພົບໂດຍກ້ອງຖ່າຍຮູບ CCD.ໃນແຕ່ລະຮອບ PCR, ແສງ fluorophore ທີ່ຕື່ນເຕັ້ນດ້ວຍຕົນເອງສາມາດຖືກກວດພົບໂດຍ CCD.

ມັນປ່ຽນແສງສະຫວ່າງທີ່ຖືກຈັບເປັນຂໍ້ມູນດິຈິຕອນ.ວິທີການນີ້ເອີ້ນວ່າ PCR ໃນເວລາທີ່ແທ້ຈິງ, ແລະມັນອະນຸຍາດໃຫ້ຕິດຕາມຄວາມຄືບຫນ້າຂອງປະຕິກິລິຍາ PCR ໃນເວລາທີ່ແທ້ຈິງ.