PCR (ຕິ​ກິ​ຣິ​ຍາ​ຕ່ອງ​ໂສ້ polymerase​) ແມ່ນ​ຫນຶ່ງ​ໃນ​ເຕັກ​ໂນ​ໂລ​ຊີ​ການ​ຂະ​ຫຍາຍ DNA ໃນ vitro​, ມີ​ປະ​ຫວັດ​ສາດ​ຂອງ​ຫຼາຍ​ກ​່​ວາ 30 ປີ​.

ເທກໂນໂລຍີ PCR ໄດ້ຖືກບຸກເບີກໂດຍ Kary Mullis ຂອງ Cetus, ສະຫະລັດອາເມລິກາໃນປີ 1983. Mullis ໄດ້ຍື່ນຄໍາຮ້ອງຂໍສິດທິບັດ PCR ໃນປີ 1985 ແລະພິມເຜີຍແຜ່ເອກະສານທາງວິຊາການ PCR ທໍາອິດກ່ຽວກັບວິທະຍາສາດໃນປີດຽວກັນ.Mullis ໄດ້ຮັບລາງວັນໂນແບລດ້ານເຄມີໃນປີ 1993 ສໍາລັບວຽກງານຂອງລາວ.

ຫຼັກການພື້ນຖານຂອງ PCR

PCR ສາມາດຂະຫຍາຍຊິ້ນສ່ວນ DNA ເປົ້າໝາຍໄດ້ຫຼາຍກວ່າໜຶ່ງລ້ານເທື່ອ.ຫຼັກການແມ່ນຢູ່ພາຍໃຕ້ການ catalysis ຂອງ DNA polymerase, ການນໍາໃຊ້ strand DNA ຂອງພໍ່ແມ່ເປັນແມ່ແບບແລະ primer ສະເພາະເປັນຈຸດເລີ່ມຕົ້ນສໍາລັບການຂະຫຍາຍ.ມັນໄດ້ຖືກ replicated ໃນ vitro ໂດຍຜ່ານຂັ້ນຕອນເຊັ່ນ: denaturation, annealing, ແລະການຂະຫຍາຍ.ຂະບວນການຂອງລູກສາວ strand DNA ເສີມກັບແມ່ແບບ DNA strand ຂອງພໍ່ແມ່.

ຂະບວນການ PCR ມາດຕະຖານແບ່ງອອກເປັນສາມຂັ້ນຕອນ:

1.Denaturation: ໃຊ້ອຸນຫະພູມສູງເພື່ອແຍກ DNA double strands.ພັນທະບັດໄຮໂດຣເຈນລະຫວ່າງສາຍ DNA ສອງເສັ້ນຖືກແຍກຢູ່ໃນອຸນຫະພູມສູງ (93-98 ℃).

2.Annealing: ຫຼັງຈາກ DNA ເສັ້ນຄູ່ຖືກແຍກອອກ, ຫຼຸດອຸນຫະພູມລົງເພື່ອໃຫ້ primer ສາມາດຜູກມັດກັບ DNA ສາຍດຽວ.

3.Extension: DNA polymerase ເລີ່ມສັງເຄາະ strands ເສີມຕາມສາຍ DNA ຈາກ primers ຜູກມັດເມື່ອອຸນຫະພູມຫຼຸດລົງ.ໃນເວລາທີ່ການຂະຫຍາຍໄດ້ຖືກສໍາເລັດ, ວົງຈອນແມ່ນສໍາເລັດ, ແລະຈໍານວນຂອງຊິ້ນ DNA ເພີ່ມຂຶ້ນສອງເທົ່າ

Reciprocating ສາມຂັ້ນຕອນເຫຼົ່ານີ້ 25-35 ເທື່ອ, ຈໍານວນຂອງຊິ້ນ DNA ຈະເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ.

ຄວາມສະຫລາດຂອງ PCR ແມ່ນວ່າ primers ທີ່ແຕກຕ່າງກັນສາມາດຖືກອອກແບບສໍາລັບ genes ເປົ້າຫມາຍທີ່ແຕກຕ່າງກັນ, ດັ່ງນັ້ນຊິ້ນສ່ວນ gene ເປົ້າຫມາຍສາມາດຂະຫຍາຍໄດ້ໃນໄລຍະເວລາສັ້ນໆ.

ມາຮອດປະຈຸ, PCR ສາມາດແບ່ງອອກເປັນສາມປະເພດ, ຄື PCR ທໍາມະດາ, PCR ປະລິມານ fluorescent ແລະ PCR ດິຈິຕອນ.

ຮຸ່ນທໍາອິດຂອງ PCR ທໍາມະດາ

ໃຊ້ເຄື່ອງມືຂະຫຍາຍ PCR ທໍາມະດາເພື່ອຂະຫຍາຍພັນທຸກໍາເປົ້າຫມາຍ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນນໍາໃຊ້ agarose gel electrophoresis ເພື່ອກວດຫາຜະລິດຕະພັນ, ພຽງແຕ່ການວິເຄາະຄຸນນະພາບສາມາດເຮັດໄດ້.

ຂໍ້ເສຍຫຼັກຂອງ PCR ຮຸ່ນທໍາອິດ:

1.ມັກການຂະຫຍາຍທີ່ບໍ່ສະເພາະ ແລະຜົນໄດ້ຮັບໃນທາງບວກທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ.

2.ການຊອກຄົ້ນຫາໃຊ້ເວລາເປັນເວລາດົນນານແລະການດໍາເນີນງານແມ່ນ cumbersome.

3.Only ການທົດສອບຄຸນນະພາບສາມາດເຮັດໄດ້

PCR ເວລາຈິງລຸ້ນທີສອງ

PCR ໃນເວລາຈິງ, ເຊິ່ງເອີ້ນກັນວ່າ qPCR, ໃຊ້ probes fluorescent ທີ່ສາມາດຊີ້ບອກຄວາມຄືບຫນ້າຂອງລະບົບຕິກິຣິຍາ, ແລະຕິດຕາມກວດກາການສະສົມຂອງຜະລິດຕະພັນຂະຫຍາຍໃຫຍ່ຂື້ນໂດຍຜ່ານການສະສົມຂອງສັນຍານ fluorescent, ແລະຕັດສິນຜົນໄດ້ຮັບໂດຍຜ່ານເສັ້ນໂຄ້ງ fluorescence.ມັນສາມາດຖືກຄິດໄລ່ດ້ວຍການຊ່ວຍເຫຼືອຂອງມູນຄ່າ Cq ແລະເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານ.

ເນື່ອງຈາກວ່າເທກໂນໂລຍີ qPCR ດໍາເນີນຢູ່ໃນລະບົບປິດ, ຄວາມເປັນໄປໄດ້ຂອງການປົນເປື້ອນແມ່ນຫຼຸດລົງ, ແລະສັນຍານ fluorescence ສາມາດຕິດຕາມການກວດສອບປະລິມານໄດ້, ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງທີ່ສຸດໃນການປະຕິບັດທາງດ້ານການຊ່ວຍແລະໄດ້ກາຍເປັນເຕັກໂນໂລຢີທີ່ເດັ່ນຊັດໃນ PCR.

ສານ fluorescent ທີ່ໃຊ້ໃນ PCR ປະລິມານ fluorescent ໃນເວລາທີ່ແທ້ຈິງສາມາດແບ່ງອອກເປັນ: TaqMan fluorescent probe, molecular beacons ແລະ fluorescent dye.

1​) TaqMan fluorescent probe​:

ໃນລະຫວ່າງການຂະຫຍາຍ PCR, ມີການເພີ່ມ fluorescent probe ສະເພາະໃນຂະນະທີ່ເພີ່ມ primer ຄູ່.ການສືບສວນແມ່ນ oligonucleotide, ແລະທັງສອງສົ້ນແມ່ນຕິດສະຫຼາກດ້ວຍກຸ່ມ fluorescent ນັກຂ່າວແລະກຸ່ມ fluorescent quencher.

ໃນເວລາທີ່ probe ແມ່ນ intact, ສັນຍານ fluorescent emitted ໂດຍກຸ່ມນັກຂ່າວໄດ້ຖືກດູດຊຶມໂດຍກຸ່ມ quenching;ໃນລະຫວ່າງການຂະຫຍາຍ PCR, ກິດຈະກໍາ exonuclease 5′-3′ ຂອງ Taq enzymes cleaves ແລະ degrades probe, ເຮັດໃຫ້ກຸ່ມ fluorescent ນັກຂ່າວແລະ quencher ກຸ່ມ fluorescent ຖືກແຍກອອກ, ດັ່ງນັ້ນລະບົບຕິດຕາມກວດກາ fluorescence ສາມາດໄດ້ຮັບສັນຍານ fluorescence, ນັ້ນແມ່ນ, ທຸກໆຄັ້ງທີ່ DNA strand fluorescent ຖືກຂະຫຍາຍອອກ, ຮູບແບບຂອງ fluorescent ແມ່ນການຂະຫຍາຍສັນຍານ. synchronized ຢ່າງສົມບູນກັບການສ້າງຕັ້ງຂອງຜະລິດຕະພັນ PCR.

2) ສີຍ້ອມ SYBR fluorescent:

ໃນລະບົບປະຕິກິລິຢາ PCR, ມີສ່ວນເກີນຂອງສີຍ້ອມ SYBR fluorescent ຖືກເພີ່ມ.ຫຼັງຈາກສີຍ້ອມ SYBR fluorescent ບໍ່ຖືກລວມເຂົ້າກັບສາຍ DNA ສອງຢ່າງໂດຍສະເພາະ, ມັນປ່ອຍສັນຍານ fluorescent.ໂມເລກຸນສີຍ້ອມ SYBR ທີ່ບໍ່ໄດ້ລວມຢູ່ໃນລະບົບຕ່ອງໂສ້ຈະບໍ່ປ່ອຍສັນຍານ fluorescent ໃດໆ, ດັ່ງນັ້ນການຮັບປະກັນສັນຍານ fluorescent ການເພີ່ມຂື້ນຂອງຜະລິດຕະພັນ PCR ແມ່ນ synchronized ຢ່າງສົມບູນກັບການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງຜະລິດຕະພັນ PCR.SYBR ພຽງແຕ່ຜູກມັດກັບ DNA ຄູ່, ດັ່ງນັ້ນເສັ້ນໂຄ້ງການລະລາຍສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກໍານົດວ່າປະຕິກິລິຍາ PCR ແມ່ນສະເພາະ.

3) ສັນຍານໂມເລກຸນ:

ມັນແມ່ນເຄື່ອງສຳຫລວດ oligonucleotide ທີ່ມີປ້າຍກຳກັບສອງວົງ stem-loop ທີ່ປະກອບເປັນໂຄງສ້າງຂອງ hairpin ປະມານ 8 ຖານຢູ່ປາຍ 5 ແລະ 3.ລໍາດັບອາຊິດນິວຄລີອິກຢູ່ທັງສອງສົ້ນໄດ້ຖືກຈັບຄູ່ກັນ, ເຮັດໃຫ້ກຸ່ມ fluorescent ແລະກຸ່ມ quenching ແຫນ້ນ.ປິດ, ບໍ່ມີ fluorescence ຈະຜະລິດ.

ຫຼັງຈາກຜະລິດຕະພັນ PCR ຖືກສ້າງຂຶ້ນ, ໃນລະຫວ່າງການຂະບວນການຫມູນວຽນ, ສ່ວນກາງຂອງ beacon ໂມເລກຸນຖືກຈັບຄູ່ກັບລໍາດັບ DNA ສະເພາະ, ແລະ gene fluorescent ຖືກແຍກອອກຈາກ gene quencher ເພື່ອຜະລິດ fluorescence.

ຂໍ້ເສຍຫຼັກຂອງ PCR ຮຸ່ນທີສອງ:

ຄວາມອ່ອນໄຫວຍັງຂາດ, ແລະການກວດຫາຕົວຢ່າງທີ່ເຮັດສໍາເນົາຕໍ່າແມ່ນບໍ່ຖືກຕ້ອງ.

ມີອິດທິພົນຂອງມູນຄ່າພື້ນຖານ, ແລະຜົນໄດ້ຮັບແມ່ນມີຄວາມອ່ອນໄຫວຕໍ່ການແຊກແຊງ.

ເມື່ອມີສານຍັບຍັ້ງ PCR ໃນລະບົບຕິກິຣິຍາ, ຜົນໄດ້ຮັບການກວດພົບແມ່ນມີຄວາມອ່ອນໄຫວຕໍ່ການແຊກແຊງ.

PCR ດິຈິຕອນຮຸ່ນທີສາມ

ດິຈິຕອລ PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) ຄິດໄລ່ຈໍານວນສໍາເນົາຂອງລໍາດັບເປົ້າຫມາຍໂດຍຜ່ານການກວດສອບຈຸດສິ້ນສຸດ, ແລະສາມາດປະຕິບັດການກວດສອບປະລິມານຢ່າງແທ້ຈິງທີ່ຖືກຕ້ອງໂດຍບໍ່ຕ້ອງໃຊ້ການຄວບຄຸມພາຍໃນແລະເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານ.

Digital PCR ໃຊ້ການກວດຫາຈຸດສິ້ນສຸດແລະບໍ່ຂຶ້ນກັບຄ່າ Ct (ຮອບວຽນ), ດັ່ງນັ້ນຕິກິຣິຍາ PCR ດິຈິຕອນໄດ້ຮັບຜົນກະທົບຫນ້ອຍໂດຍປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍ, ແລະຄວາມທົນທານຕໍ່ PCR ປະຕິກິລິຍາ inhibitors ໄດ້ຖືກປັບປຸງ, ມີຄວາມຖືກຕ້ອງສູງແລະການສືບພັນ.

ເນື່ອງຈາກຄຸນລັກສະນະຂອງຄວາມອ່ອນໄຫວແລະຄວາມຖືກຕ້ອງສູງ, ມັນບໍ່ໄດ້ຖືກແຊກແຊງໄດ້ງ່າຍໂດຍ inhibitors ຕິກິຣິຍາ PCR, ແລະມັນສາມາດບັນລຸປະລິມານຢ່າງແທ້ຈິງທີ່ບໍ່ມີຜະລິດຕະພັນມາດຕະຖານ, ເຊິ່ງໄດ້ກາຍເປັນຈຸດຮ້ອນຂອງການຄົ້ນຄວ້າແລະຄໍາຮ້ອງສະຫມັກ.

ອີງຕາມຮູບແບບທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງຫນ່ວຍປະຕິກິລິຍາ, ມັນສາມາດແບ່ງອອກເປັນສາມປະເພດຕົ້ນຕໍ: ລະບົບ microfluidic, chip ແລະ droplet.

1) Microfluidic digital PCR, mdPCR:

ອີງໃສ່ເຕັກໂນໂລຢີ microfluidic, ແບບ DNA ຖືກແຍກອອກ.ເຕັກໂນໂລຊີ microfluidic ສາມາດຮັບຮູ້ຕົວຢ່າງ nano-upgrading ຫຼືການຜະລິດຂອງ droplets ຂະຫນາດນ້ອຍ, ແຕ່ droplets ຕ້ອງການວິທີການ adsorption ພິເສດແລະຫຼັງຈາກນັ້ນສົມທົບກັບລະບົບປະຕິກິລິຍາ PCR.mdPCR ໄດ້ຄ່ອຍໆຖືກຮັບຮອງເອົາໂດຍວິທີການອື່ນແທນ.

2) PCR ດິຈິຕອລແບບ Droplet, ddPCR:

ໃຊ້ເທກໂນໂລຍີການສ້າງ droplet ນ້ໍາໃນນ້ໍາມັນເພື່ອປຸງແຕ່ງຕົວຢ່າງເປັນ droplets, ແລະແບ່ງລະບົບຕິກິຣິຍາທີ່ປະກອບດ້ວຍໂມເລກຸນອາຊິດ nucleic ເປັນພັນຂອງ nanoscale droplets, ແຕ່ລະຄົນບໍ່ມີໂມເລກຸນເປົ້າຫມາຍຂອງອາຊິດ nucleic ທີ່ຈະກວດພົບ, ຫຼືປະກອບດ້ວຍຫນຶ່ງຫາຫຼາຍໂມເລກຸນເປົ້າຫມາຍຂອງອາຊິດ nucleic ທີ່ຈະທົດສອບ.

3) chip-based digital PCR, cdPCR:

ໃຊ້ເທກໂນໂລຍີເສັ້ນທາງຂອງນ້ໍາປະສົມປະສານເພື່ອແກະສະຫລັກ microtubes ແລະ microcavities ເທິງແຜ່ນ silicon wafers ຫຼືແກ້ວ quartz, ແລະຄວບຄຸມການໄຫຼຂອງການແກ້ໄຂໂດຍຜ່ານປ່ຽງຄວບຄຸມທີ່ແຕກຕ່າງກັນ, ແລະແບ່ງທາດແຫຼວຕົວຢ່າງເຂົ້າໄປໃນ nanometers ຂະຫນາດດຽວກັນເຂົ້າໄປໃນທໍ່ຕິກິຣິຍາສໍາລັບປະຕິກິລິຍາ PCR ດິຈິຕອນເພື່ອບັນລຸປະລິມານຢ່າງແທ້ຈິງ.

ຂໍ້ເສຍຫຼັກຂອງ PCR ລຸ້ນທີສາມ:

ອຸປະກອນແລະ reagents ແມ່ນລາຄາແພງ.

ຄວາມຕ້ອງການຄຸນນະພາບຂອງແມ່ແບບແມ່ນສູງ.ຖ້າປະລິມານແມ່ແບບເກີນປະລິມານຂອງລະບົບຈຸນລະພາກ, ມັນຈະເປັນໄປບໍ່ໄດ້ທີ່ຈະກໍານົດປະລິມານ, ແລະຖ້າມັນນ້ອຍເກີນໄປ, ຄວາມຖືກຕ້ອງຂອງປະລິມານຈະຫຼຸດລົງ.

ບວກທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງຍັງສາມາດຖືກສ້າງຂື້ນເມື່ອມີການຂະຫຍາຍທີ່ບໍ່ສະເພາະ.