PCR, ຫຼາຍ PCR, ຢູ່ໃນ PCR, PCR ປີ້ນກັບກັນ, RT-PCR, qPCR (1)–PCR

ພວກເຮົາຈະຄັດອອກແນວຄວາມຄິດ, ຂັ້ນຕອນແລະລາຍລະອຽດຂອງ PCR ຕ່າງໆ

Ⅰ. PCR

ປະຕິກິລິຍາລະບົບຕ່ອງໂສ້ Polymerase, ເອີ້ນວ່າ PCR, ແມ່ນເຕັກໂນໂລຢີຊີວະພາບໂມເລກຸນທີ່ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອຂະຫຍາຍຊິ້ນສ່ວນ DNA ສະເພາະ.ມັນສາມາດຖືວ່າເປັນການຈໍາລອງ DNA ພິເສດໃນ vitro.DNA polymerase (DNA Polymerase I) ໄດ້ຖືກຄົ້ນພົບໃນຕົ້ນປີ 1955, ແລະ Klenow Fragment ຂອງ E. Coli, ເຊິ່ງມີມູນຄ່າການທົດລອງແລະການປະຕິບັດ, ໄດ້ຖືກຄົ້ນພົບໂດຍ Dr. H. Klenow ໃນຕົ້ນປີ 1970, ແຕ່ເນື່ອງຈາກວ່າ enzyme ນີ້ບໍ່ທົນທານຕໍ່ອຸນຫະພູມ, ອຸນຫະພູມສູງສາມາດ degenerate ມັນ, ດັ່ງນັ້ນມັນຈຶ່ງບໍ່ຕອບສະຫນອງຕ່ອງໂສ້ການປະຕິກິລິຢາ polymerase ສູງ.ເອນໄຊທີ່ໃຊ້ໃນທຸກມື້ນີ້ (ເອີ້ນວ່າ Taq polymerase), ໄດ້ຖືກແຍກອອກຈາກ Thermus aquaticus, ເຊື້ອແບັກທີເຣັຍໃນລະດູຮ້ອນໃນປີ 1976. ຄຸນລັກສະນະຂອງມັນແມ່ນມັນສາມາດຕ້ານທານກັບອຸນຫະພູມສູງແລະເປັນເອນໄຊທີ່ເຫມາະສົມ, ແຕ່ມັນຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງຫຼັງຈາກຊຸມປີ 1980.ແນວຄວາມຄິດຕົ້ນສະບັບຂອງຕົ້ນແບບ primitive ຕົ້ນສະບັບຂອງ PCR ແມ່ນຄ້າຍຄືກັບການສ້ອມແປງ gene ແລະການຄັດລອກ, ເຊິ່ງໄດ້ຖືກສະເຫນີໂດຍ Dr. KJell Kleppe ໃນປີ 1971. ລາວໄດ້ເຜີຍແຜ່ການຄັດລອກ gene ທໍາອິດທີ່ງ່າຍດາຍແລະສັ້ນ (ຄ້າຍຄືກັນກັບປະຕິກິລິຍາສອງວົງຈອນທໍາອິດຂອງ PCR).PCR ພັດທະນາໃນມື້ນີ້ໄດ້ຖືກພັດທະນາໂດຍທ່ານດຣ Kary B. Mullis ໃນປີ 1983. ທ່ານດຣ Mullis ໄດ້ຮັບໃຊ້ບໍລິສັດ PE ໃນປີນັ້ນ, ດັ່ງນັ້ນ PE ມີສະຖານະພາບພິເສດໃນອຸດສາຫະກໍາ PCR.ທ່ານດຣ Mullis ໄດ້ພິມເຜີຍແຜ່ເອກະສານທີ່ກ່ຽວຂ້ອງຄັ້ງທໍາອິດກັບ Saiki ແລະອື່ນໆໃນປີ 1985. ນັບຕັ້ງແຕ່ນັ້ນມາ, ການນໍາໃຊ້ PCR ແມ່ນຫຼາຍພັນກິໂລແມັດຕໍ່ມື້, ແລະຄຸນນະພາບຂອງເອກະສານທີ່ກ່ຽວຂ້ອງສາມາດເວົ້າໄດ້ວ່າເຮັດໃຫ້ວິທີການຄົ້ນຄ້ວາອື່ນໆຈໍານວນຫຼາຍ unpalatable.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ເທກໂນໂລຍີ PCR ຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງໃນການຄົ້ນຄວ້າວິທະຍາສາດດ້ານຊີວະສາດແລະການນໍາໃຊ້ທາງດ້ານການຊ່ວຍ, ກາຍເປັນເຕັກໂນໂລຢີທີ່ສໍາຄັນທີ່ສຸດຂອງການຄົ້ນຄວ້າຊີວະສາດໂມເລກຸນ.Mullis ຍັງໄດ້ຊະນະລາງວັນ Nobel ໃນປີ 1993 ສາຂາເຄມີ.

PCRຫຼັກການ

ຫຼັກການພື້ນຖານຂອງເທກໂນໂລຍີ PCR ແມ່ນຄ້າຍຄືກັນກັບຂະບວນການຈໍາລອງແບບທໍາມະຊາດຂອງ DNA, ແລະຄວາມສະເພາະຂອງມັນແມ່ນຂຶ້ນກັບ primer oligonucleotide ທີ່ປະສົມປະສານກັບທັງສອງປາຍຂອງລໍາດັບເປົ້າຫມາຍ.PCR ແມ່ນປະກອບດ້ວຍ degeneration-annealing-extending ສາມຂັ້ນຕອນປະຕິກິລິຍາພື້ນຖານ: ①ການເສື່ອມຂອງ DNA ຂອງແມ່ແບບ: ຫຼັງຈາກ DNA ຂອງແມ່ແບບຖືກໃຫ້ຄວາມຮ້ອນປະມານ 93 ° C ສໍາລັບໄລຍະເວລາທີ່ແນ່ນອນ, ການແກ້ໄຂ DNA ຄູ່ສໍາລັບ DNA ສອງຕ່ອງໂສ້ທີ່ສ້າງຂຶ້ນໂດຍການຂະຫຍາຍ PCR ຂອງແມ່ແບບ DNA ອອກຈາກ, ເຮັດໃຫ້ມັນເປັນຕ່ອງໂສ້ດຽວເພື່ອກະກຽມຮອບຕໍ່ໄປ.②​ການ​ເຊື່ອມ​ສານ​ຂອງ​ແມ່​ແບບ DNA ແລະ primer: ຫຼັງ​ຈາກ​ທີ່ DNA ແມ່​ແບບ​ໄດ້​ຮັບ​ຄວາມ​ຮ້ອນ​ແລະ degenerated ເປັນ​ຕ່ອງ​ໂສ້​ດຽວ​, ອຸນ​ຫະ​ພູມ​ຫຼຸດ​ລົງ​ປະ​ມານ 55°C​.ລໍາດັບເສີມຂອງ primer ແລະແມ່ແບບ DNA ແບບຕ່ອງໂສ້ດຽວ.③ການຂະຫຍາຍຂອງ primer: ແບບ DNA-ການຜູກມັດ primer ແມ່ນອີງໃສ່ການປະຕິບັດຂອງ TaqDNA polymerase, ກັບ dNTP ເປັນວັດຖຸດິບປະຕິກິລິຢາ.ຮັກສາຫຼັກການຂອງການຈໍາລອງ, ສັງເຄາະລະບົບຕ່ອງໂສ້ການຄັດລອກແບບເຄິ່ງສະຫງວນໃຫມ່ທີ່ເສີມສ້າງລະບົບຕ່ອງໂສ້ DNA ຂອງແມ່ແບບ, ແລະຂະບວນການເຮັດຊ້ໍາອີກສາມຂະບວນການສາມາດໄດ້ຮັບ "ຕ່ອງໂສ້ການຄັດລອກເຄິ່ງສະຫງວນ", ແລະລະບົບຕ່ອງໂສ້ໃຫມ່ນີ້ສາມາດໃຊ້ໄດ້ອີກເທື່ອຫນຶ່ງເພື່ອກາຍເປັນແມ່ແບບສໍາລັບວົງຈອນຕໍ່ໄປ.ມັນໃຊ້ເວລາ 2-4 ນາທີເພື່ອເຮັດສໍາເລັດ loop, gene ເປົ້າຫມາຍສາມາດໄດ້ຮັບການຂະຫຍາຍຫຼາຍລ້ານເທື່ອໃນ 2-3 ຊົ່ວໂມງ.

ມາດຕະຖານPCRລະບົບປະຕິກິລິຍາ

ຫ້າອົງປະກອບຂອງປະຕິກິລິຍາ PCR

ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນມີຫ້າຊະນິດຂອງສານທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບປະຕິກິລິຍາ PCR, ຄື primer, enzyme, dNTP, template ແລະ buffer (ຕ້ອງການ Mg2+).[ຂັ້ນຕອນ PCR]

ຂະບວນການ PCR ມາດຕະຖານແບ່ງອອກເປັນສາມຂັ້ນຕອນ

1. ການເສື່ອມຂອງ DNA (90°C-96°C): ແມ່ແບບ DNA ສາຍຕ່ອງໂສ້ຄູ່ພາຍໃຕ້ການປະຕິບັດຄວາມຮ້ອນ, ພັນທະບັດຂອງໄຮໂດເຈນແຕກ, ປະກອບເປັນ DNA ສາຍຕ່ອງໂສ້ດຽວ.

2. Annealing (25℃ -65℃): ອຸນຫະພູມຂອງລະບົບໄດ້ຖືກຫຼຸດລົງ, primer ໄດ້ຖືກລວມເຂົ້າກັບແມ່ແບບ DNA ເພື່ອສ້າງເປັນລະບົບຕ່ອງໂສ້ຄູ່ທ້ອງຖິ່ນ.

3. ການຂະຫຍາຍ (70 ℃ -75 ℃): ພາຍໃຕ້ການປະຕິບັດຂອງ enzyme Taq (ປະມານ 72 ° C, ກິດຈະກໍາທີ່ດີທີ່ສຸດ), dNTP ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນວັດຖຸດິບ, ຂະຫຍາຍຈາກ 5′ ປາຍຂອງ primer → 3′ ສິ້ນສຸດ, ການສັງເຄາະແລະແມ່ແບບເສີມເຊິ່ງກັນແລະກັນລະບົບຕ່ອງໂສ້ DNA.

ແຕ່ລະວົງຈອນແມ່ນ denatured, annealed ແລະຂະຫຍາຍ, ສອງເທົ່າເນື້ອໃນ DNA.ໃນປັດຈຸບັນ, ເນື່ອງຈາກພື້ນທີ່ຂະຫຍາຍສັ້ນ, ບາງ PCR ສາມາດ replicated ໃນເວລາສັ້ນໆ, ເຖິງແມ່ນວ່າກິດຈະກໍາຂອງ enzyme Taq ແມ່ນບໍ່ເຫມາະສົມ, ດັ່ງນັ້ນມັນສາມາດປ່ຽນເປັນສອງຂັ້ນຕອນ, ນັ້ນແມ່ນ, ການຫມຸນແລະການຂະຫຍາຍສາມາດປະຕິບັດໄດ້ຢູ່ທີ່ 60 ° C-65 ° C ໃນເວລາດຽວກັນ.ເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນຂະບວນການຍົກແລະຄວາມເຢັນແລະປັບປຸງຄວາມໄວຕອບສະຫນອງ.

ຄຸນນະສົມບັດປະຕິກິລິຍາ PCR

●ຄວາມສະເພາະສູງ

ປັດໃຈຕັດສິນສະເພາະຂອງການຕອບສະໜອງ PCR ແມ່ນ: ①ການປະສົມປະສານສະເພາະຂອງ primer ແລະ DNA ແມ່ແບບ.②ຫຼັກການຂອງການຈັບຄູ່ພື້ນຖານ.③ຄວາມສັດຊື່ຂອງປະຕິກິລິຍາສັງເຄາະ TaqDNA polymerase.④ ຄວາມ​ສະ​ເພາະ​ແລະ​ການ​ອະ​ນຸ​ລັກ​ຂອງ​ເຊື້ອ​ສາຍ​ເປົ້າ​ຫມາຍ​.

ການປະສົມປະສານທີ່ຖືກຕ້ອງຂອງ primers ແລະແມ່ແບບແມ່ນສໍາຄັນ.ການຜູກມັດຂອງ primer ແລະແມ່ແບບແລະການຂະຫຍາຍຂອງລະບົບຕ່ອງໂສ້ primer ແມ່ນອີງໃສ່ຫຼັກການຂອງການຈັບຄູ່ຖານທີ່ເປັນດ່າງ.ຄວາມສັດຊື່ຂອງປະຕິກິລິຍາສັງເຄາະ polymerase ແລະການຕໍ່ຕ້ານອຸນຫະພູມສູງຂອງ Taq DNA polymerase ເພື່ອເຮັດໃຫ້ການຜູກມັດ (ສານປະກອບ) ຂອງແມ່ແບບແລະ primer ໃນຕິກິຣິຍາສາມາດປະຕິບັດໃນອຸນຫະພູມທີ່ສູງຂຶ້ນ.ສະເພາະຂອງການປະສົມປະສານແມ່ນເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ.ຄລິບສາມາດຮັກສາຄວາມຖືກຕ້ອງໃນລະດັບສູງ.ໂດຍການເລືອກເຂດພັນທຸກໍາເປົ້າຫມາຍທີ່ມີຄວາມອະນຸລັກສູງແລະການອະນຸລັກສູງ, ສະເພາະຂອງມັນສູງກວ່າ.

● ຄວາມອ່ອນໄຫວສູງ

ປະລິມານການຜະລິດຂອງຜະລິດຕະພັນ PCR ແມ່ນເພີ່ມຂຶ້ນໂດຍດັດຊະນີ, ເຊິ່ງສາມາດຂະຫຍາຍຮູບແບບເລີ່ມຕົ້ນຂອງ Picker (PG = 10-12) ເພື່ອເພີ່ມລະດັບຂອງ microcontroller ໃນລະດັບ micrograms (μg = -6).ຈຸລັງເປົ້າໝາຍສາມາດກວດພົບໄດ້ຈາກ 1 ລ້ານຈຸລັງ;ໃນການກວດຫາໄວຣັສ, ຄວາມອ່ອນໄຫວຂອງ PCR ສາມາດບັນລຸ 3 RFUs (ຈຸດຫວ່າງເປົ່າສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນຫນ່ວຍ);ອັດຕາການກວດພົບຕໍາ່ສຸດທີ່ໃນວິທະຍາສາດຂອງເຊື້ອແບັກທີເຣັຍແມ່ນ 3 ເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ.

●ງ່າຍດາຍແລະໄວ

ການສະທ້ອນ PCR ໃຊ້ Taq DNA polymerase ທີ່ມີອຸນຫະພູມສູງ, ເຊິ່ງເພີ່ມການແກ້ໄຂປະຕິກິລິຍາໃນເວລາດຽວ, ນັ້ນແມ່ນ, ປະຕິກິລິຍາ degeneration-anneal-extension ກ່ຽວກັບການແກ້ໄຂ DNA amplification ແລະຫມໍ້ອາບນ້ໍາ.ໂດຍທົ່ວໄປ, ປະຕິກິລິຍາຂະຫຍາຍໃຫຍ່ຂື້ນແມ່ນສໍາເລັດໃນ 2 ຫາ 4 ຊົ່ວໂມງ.ຜະລິດຕະພັນເສີມແມ່ນການວິເຄາະໂດຍທົ່ວໄປໂດຍດາບໄຟຟ້າ, ແລະບໍ່ຈໍາເປັນຕ້ອງໃຊ້ isotopes, ບໍ່ມີມົນລະພິດ radioactive, ແລະການສົ່ງເສີມງ່າຍ.

● ຄວາມບໍລິສຸດຂອງຕົວຢ່າງແມ່ນຕໍ່າ

ບໍ່ຈໍາເປັນຕ້ອງແຍກເຊື້ອໄວຣັສຫຼືເຊື້ອແບັກທີເຣັຍແລະຈຸລັງວັດທະນະທໍາ.ຜະລິດຕະພັນດິບ DNA ແລະ RNA ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເປັນເຄື່ອງຂະຫຍາຍສຽງ.ການກວດຫາການຂະຫຍາຍ DNA ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ໂດຍກົງໂດຍໃຊ້ຕົວຢ່າງທາງຄລີນິກເຊັ່ນ: ເລືອດ, ທາດແຫຼວໃນຮ່າງກາຍ, ນໍ້າຢາລ້າງໄອ, ຜົມ, ຈຸລັງ, ແລະເນື້ອເຍື່ອທີ່ມີຊີວິດ.

PCRບັນຫາທົ່ວໄປ

● ທາງລົບທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ, ບໍ່ມີແຖບຂະຫຍາຍ

ຂັ້ນຕອນທີ່ສໍາຄັນຂອງຕິກິຣິຍາ PCR ປະກອບມີ: ①ການກະກຽມຂອງອາຊິດ nucleic ແມ່ແບບ, ②ຄຸນນະພາບແລະຄວາມສະເພາະຂອງ primers, ③ຄຸນນະພາບຂອງ enzymes ④ PCR ວົງຈອນສະພາບ.ການຊອກຫາເຫດຜົນຍັງຄວນໄດ້ຮັບການວິເຄາະແລະສຶກສາສໍາລັບການເຊື່ອມຕໍ່ຂ້າງເທິງ.

ແມ່ແບບ: ① ແມ່ແບບປະກອບມີທາດໂປຼຕີນຈາກຫຼາກຫຼາຍຊະນິດ, ② ແມ່ແບບມີຕົວຍັບຍັ້ງ Taq enzyme, ③ ທາດໂປຼຕີນໃນແມ່ແບບບໍ່ໄດ້ຖືກກໍາຈັດ, ໂດຍສະເພາະແມ່ນທາດໂປຼຕີນຈາກກຸ່ມໃນໂຄໂມໂຊມ.⑤ ການເສື່ອມຂອງອາຊິດນິວຄລີອິກ Deminer ແມ່ນບໍ່ຄົບຖ້ວນ.ໃນເວລາທີ່ຄຸນນະພາບຂອງ enzymes ແລະ primers ແມ່ນດີ, ບໍ່ມີແຖບຂະຫຍາຍ, ເຊິ່ງສ່ວນຫຼາຍແມ່ນການປິ່ນປົວການຍ່ອຍອາຫານຂອງຕົວຢ່າງ.ມີບາງສິ່ງບາງຢ່າງທີ່ຜິດພາດກັບຂະບວນການສະກັດເອົາອາຊິດ nucleic ຂອງແມ່ແບບ, ດັ່ງນັ້ນເພື່ອກະກຽມການແກ້ໄຂການຍ່ອຍອາຫານທີ່ມີປະສິດທິພາບແລະຫມັ້ນຄົງ, ຂັ້ນຕອນຂອງມັນຄວນໄດ້ຮັບການແກ້ໄຂແລະບໍ່ປ່ຽນແປງໂດຍຕົນເອງ.

Enzyme inactivation: ຄວນໃຊ້ enzyme ໃຫມ່ ຫຼື enzymes ເກົ່າ ແລະ ໃໝ່ ຮ່ວມກັນເພື່ອວິເຄາະວ່າກິດຈະກໍາຂອງ enzyme ສູນເສຍຫຼືບໍ່ພຽງພໍ, ນໍາໄປສູ່ການລົບທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ.ມັນຄວນຈະສັງເກດເຫັນວ່າ enzyme Taq ຫຼື ethidium bromide ບາງຄັ້ງກໍ່ຖືກລືມ.

Primer: ຄຸນນະພາບຂອງ primer, ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ primer, ແລະບໍ່ວ່າຈະເປັນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ primer ສອງແມ່ນສົມມາດ.ມັນເປັນເຫດຜົນທົ່ວໄປສໍາລັບຄວາມລົ້ມເຫຼວຂອງ PCR ຫຼືແຖບທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນແມ່ນບໍ່ເຫມາະສົມແລະມັກຈະແຜ່ກະຈາຍ.ມີບັນຫາກ່ຽວກັບຄຸນນະພາບຂອງ primers ຂອງຈໍານວນ batch ບາງ.ທັງສອງ primers ມີຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສູງແລະຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຕ່ໍາ, ເຮັດໃຫ້ການຂະຫຍາຍ asymmetric ປະສິດທິພາບຕ່ໍາ.ມາດຕະການຕ້ານແມ່ນ: ①ເລືອກ primer ທີ່ດີເພື່ອສັງເຄາະຫນ່ວຍ.② ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ primer ບໍ່ພຽງແຕ່ຂຶ້ນກັບຄ່າ OD, ແຕ່ຍັງເອົາໃຈໃສ່ກັບທາດແຫຼວຕົ້ນສະບັບຂອງ primer ເພື່ອເຮັດໃຫ້ນ້ໍາ agar gel electrophoresis.ຕ້ອງມີເຂດແຖບ primer, ແລະຄວາມສະຫວ່າງຂອງ primers ທັງສອງຄວນຈະສອດຄ່ອງໂດຍທົ່ວໄປ.ສາຍແອວ, PCR ອາດຈະລົ້ມເຫລວໃນເວລານີ້, ແລະມັນຄວນຈະຖືກແກ້ໄຂດ້ວຍຫນ່ວຍງານສັງເຄາະ primer.ຖ້າ primer ສູງ, ຄວາມສະຫວ່າງແມ່ນຕໍ່າ, ແລະຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງມັນຕ້ອງມີຄວາມສົມດູນເມື່ອເຈືອຈາງ.③ primer ຄວນຖືກຈ່າຍແລະເກັບຮັກສາໄວ້ໃນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສູງເພື່ອປ້ອງກັນການແຊ່ແຂງຫຼາຍຫຼືເຄື່ອງເຮັດຄວາມເຢັນໃນໄລຍະຍາວຂອງຕູ້ເຢັນ, ເຊິ່ງຈະເຮັດໃຫ້ primer ເສຍຫາຍແລະຊຸດໂຊມ.④ ການອອກແບບຂອງ primer ແມ່ນບໍ່ສົມເຫດສົມຜົນ, ເຊັ່ນ: ຄວາມຍາວຂອງ primer ບໍ່ພຽງພໍ, ແລະ di cluster ແມ່ນສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນລະຫວ່າງ primers.

Mg2+ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ: ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ Mg2+ ion ມີຜົນກະທົບອັນໃຫຍ່ຫຼວງຕໍ່ປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍ PCR.ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຫຼາຍເກີນໄປສາມາດຫຼຸດຜ່ອນການຮ່ວມເພດກົງກັນຂ້າມຂອງການຂະຫຍາຍ PCR.ຖ້າຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຕໍ່າເກີນໄປ, ຜົນຜະລິດຂະຫຍາຍ PCR ຈະເຮັດໃຫ້ການຂະຫຍາຍ PCR ລົ້ມເຫລວໂດຍບໍ່ມີແຖບຂະຫຍາຍ.

ການປ່ຽນແປງປະລິມານຕິກິຣິຍາ: ປະລິມານທີ່ໃຊ້ໃນການຂະຫຍາຍ PCR ແມ່ນ 20ul, 30ul, ແລະ 50ul ຫຼື 100uL, ປະລິມານຂະຫນາດໃຫຍ່ຂອງຄໍາຮ້ອງສະຫມັກສໍາລັບການຂະຫຍາຍ PCR ແມ່ນຖືກກໍານົດຕາມຈຸດປະສົງທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງການຄົ້ນຄວ້າວິທະຍາສາດແລະການທົດສອບທາງດ້ານການຊ່ວຍ.ຫຼັງຈາກເຮັດໃຫ້ປະລິມານຂະຫນາດນ້ອຍເຊັ່ນ 20ul, ມັນເປັນສິ່ງຈໍາເປັນທີ່ຈະເຮັດໃຫ້ສະພາບຂອງສາຍໄຟໃນເວລາທີ່ເຮັດໃຫ້ຂະຫນາດ, ຖ້າບໍ່ດັ່ງນັ້ນມັນຈະລົ້ມເຫລວ.

ເຫດຜົນທາງກາຍະພາບ: ການຫັນປ່ຽນເປັນສິ່ງສໍາຄັນຫຼາຍສໍາລັບການຂະຫຍາຍ PCR.ຖ້າອຸນຫະພູມ degeneration ຕ່ໍາ, ໄລຍະເວລາ degeneration ແມ່ນສັ້ນ, ມັນມີແນວໂນ້ມທີ່ຈະເກີດຂຶ້ນໃນທາງລົບທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ;ອຸນຫະພູມ annealing ຕ່ໍາເກີນໄປສາມາດເຮັດໃຫ້ amplification ທີ່ບໍ່ແມ່ນສະເພາະແລະຫຼຸດຜ່ອນປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍສະເພາະ.ມີຜົນກະທົບສູງຕໍ່ການປະສົມປະສານຂອງ primers ແລະ templates ເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍ PCR.ບາງຄັ້ງມັນຈໍາເປັນຕ້ອງໃຊ້ເຄື່ອງວັດແທກອຸນຫະພູມມາດຕະຖານເພື່ອກວດຫາຄວາມປ່ຽນແປງ, ການຫມູນວຽນແລະອຸນຫະພູມທີ່ຂະຫຍາຍຢູ່ໃນເຄື່ອງຂະຫຍາຍຫຼືຫມໍ້ຫຸງຕົ້ມນ້ໍາ, ເຊິ່ງເປັນຫນຶ່ງໃນເຫດຜົນສໍາລັບຄວາມລົ້ມເຫຼວຂອງ PCR.

ຕົວແປຂອງລໍາດັບເປົ້າຫມາຍ: ຖ້າລໍາດັບເປົ້າຫມາຍເກີດຂຶ້ນ, ການກາຍພັນຫຼືການລົບ, ການລວມຕົວຂອງຕົ້ນແບບແລະແມ່ແບບຖືກລວມເຂົ້າກັນ, ຫຼືເນື່ອງຈາກການຂາດລໍາດັບເປົ້າຫມາຍ, primer ແລະ template ຈະສູນເສຍລໍາດັບທີ່ສົມບູນ, ແລະການຂະຫຍາຍ PCR ຂອງມັນຈະບໍ່ປະສົບຜົນສໍາເລັດ.

● ບວກທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ

ແຖບການຂະຫຍາຍ PCR ປະກົດວ່າສອດຄ່ອງກັບແຖບລໍາດັບເປົ້າຫມາຍ, ແລະບາງຄັ້ງແຖບຂອງມັນມີຄວາມດີແລະສູງກວ່າ.

ການອອກແບບ primer ແມ່ນບໍ່ເຫມາະສົມ: ລໍາດັບ amplification ທີ່ເລືອກແລະລໍາດັບ amplification ທີ່ບໍ່ແມ່ນຈຸດປະສົງມີ homologous, ດັ່ງນັ້ນໃນເວລາທີ່ PCR amplification, ຜະລິດຕະພັນ PCR amplified ແມ່ນລໍາດັບທີ່ບໍ່ແມ່ນຈຸດປະສົງ.ລໍາດັບເປົ້າຫມາຍສັ້ນເກີນໄປຫຼື primer ສັ້ນເກີນໄປ, ແລະມັນມັກຈະເປັນບວກທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ.ຕ້ອງໄດ້ຮັບການອອກແບບໃຫມ່.

ມົນລະພິດຂ້າມຂອງລໍາດັບເປົ້າຫມາຍຫຼືຜະລິດຕະພັນຂະຫຍາຍ: ມີສອງເຫດຜົນສໍາລັບມົນລະພິດນີ້: ທໍາອິດ, ມົນລະພິດຂ້າມຂອງ genome ທັງຫມົດຫຼືສ່ວນຂະຫນາດໃຫຍ່, ນໍາໄປສູ່ການບວກທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ.ປະເພດຂອງການບວກທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງນີ້ສາມາດແກ້ໄຂໄດ້ໂດຍວິທີການດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້: ຈົ່ງລະມັດລະວັງແລະອ່ອນໂຍນໃນລະຫວ່າງການປະຕິບັດງານເພື່ອປ້ອງກັນບໍ່ໃຫ້ລໍາດັບເປົ້າຫມາຍຈາກການຫາຍໃຈເຂົ້າໄປໃນປືນຕົວຢ່າງຫຼືກະແຈກກະຈາຍອອກຈາກທໍ່ centrifugal.ຍົກເວັ້ນ enzymes ແລະສານທີ່ບໍ່ສາມາດທົນກັບອຸນຫະພູມສູງ, reagents ຫຼືອຸປະກອນທັງຫມົດຄວນໄດ້ຮັບການຂ້າເຊື້ອດ້ວຍຄວາມກົດດັນສູງ.ທໍ່ centrifugal ແລະຕົວຢ່າງຄວນຖືກນໍາໃຊ້ໃນເວລາດຽວ.ໃນເວລາທີ່ມີຄວາມຈໍາເປັນ, ກ່ອນທີ່ຈະເພີ່ມຕົວຢ່າງ, ທໍ່ຕິກິຣິຍາແລະ reagent ໄດ້ຖືກສໍາຜັດກັບຮັງສີ ultraviolet ເພື່ອທໍາລາຍອາຊິດ nucleic ທີ່ມີຢູ່ແລ້ວ.ອັນທີສອງ, ຊິ້ນສ່ວນນ້ອຍໆໃນມົນລະພິດທາງອາກາດ.ຊິ້ນສ່ວນນ້ອຍໆເຫຼົ່ານີ້ສັ້ນກວ່າລໍາດັບເປົ້າຫມາຍ, ແຕ່ພວກມັນມີຄວາມຄ້າຍຄືກັນທີ່ແນ່ນອນ.ມັນ​ສາ​ມາດ​ໄດ້​ຮັບ​ການ spliced ​​ກັບ​ແຕ່​ລະ​ຄົນ​.ຫຼັງຈາກປະກອບ primers, ຜະລິດຕະພັນ PCR ສາມາດຂະຫຍາຍໄດ້, ເຊິ່ງຈະເຮັດໃຫ້ການຜະລິດໃນທາງບວກທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ.ມັນສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນຫຼືລົບລ້າງວິທີການ PCR ຮັງ.

● ປາກົດແຖບການຂະຫຍາຍທີ່ບໍ່ສະເພາະ

ແຖບທີ່ປາກົດຫຼັງຈາກການຂະຫຍາຍ PCR ແມ່ນບໍ່ສອດຄ່ອງກັບຂະຫນາດທີ່ຄາດໄວ້, ຫຼືຂະຫນາດໃຫຍ່ຫຼືຂະຫນາດນ້ອຍ, ຫຼືໃນເວລາດຽວກັນ, ຫຼືໃນເວລາດຽວກັນ, ແຖບຂະຫຍາຍສະເພາະແລະແຖບຂະຫຍາຍທີ່ບໍ່ສະເພາະ.ການປະກົດຕົວຂອງແຖບທີ່ບໍ່ແມ່ນສະເພາະແມ່ນ: ທໍາອິດ, primers ແມ່ນບໍ່ສົມບູນແບບປະສົມປະສານກັບລໍາດັບເປົ້າຫມາຍ, ຫຼື polymerization ຂອງ primer ເພື່ອສ້າງເປັນກຸ່ມ di.ອັນທີສອງແມ່ນວ່າຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ MG2+ ions ແມ່ນສູງເກີນໄປ, ອຸນຫະພູມການຫມູນວຽນແມ່ນຕໍ່າເກີນໄປ, ແລະຈໍານວນຂອງວົງຈອນ PCR ແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງ.ອັນທີສອງ, ຄຸນນະພາບແລະປະລິມານຂອງ enzymes.ເລື້ອຍໆ, enzymes ຂອງບາງແຫຼ່ງແມ່ນມັກຈະເປັນແຖບທີ່ບໍ່ແມ່ນພິເສດແລະ enzymes ຂອງແຫຼ່ງອື່ນໆແມ່ນບໍ່ເກີດຂຶ້ນ.ບາງຄັ້ງການຂະຫຍາຍເອນໄຊທີ່ບໍ່ສະເພາະກໍ່ເກີດຂຶ້ນ.ມາດ​ຕະ​ການ​ຕອບ​ໂຕ້​ຄື: ການ​ອອກ​ແບບ​ຄືນ​ໃໝ່​ສິ່ງ​ດຶງ​ດູດ​ຖ້າ​ຈຳ​ເປັນ.ຫຼຸດຜ່ອນປະລິມານຂອງ enzyme ຫຼືທົດແທນ enzyme ຂອງແຫຼ່ງອື່ນ.ຫຼຸດຜ່ອນປະລິມານປະຖົມ, ເພີ່ມປະລິມານຂອງແມ່ແບບທີ່ເຫມາະສົມ, ແລະຫຼຸດຜ່ອນຈໍານວນຂອງຮອບວຽນ.ເພີ່ມອຸນຫະພູມການຫມູນວຽນຢ່າງຖືກຕ້ອງ ຫຼືໃຊ້ວິທີຈຸດອຸນຫະພູມສອງຈຸດ (ການເສື່ອມສະພາບ 93°C, ການໜຽວ ແລະຂະຫຍາຍອອກຢູ່ທີ່ປະມານ 65°C).

● ປະກົດມີຮອຍຂີດຂ່ວນ ຫຼື tape smear

ການຂະຫຍາຍ PCR ບາງຄັ້ງເບິ່ງຄືວ່າຖືກ ​​ນຳ ໃຊ້ຫຼືປອກເປືອກຫຼືສາຍແອວທີ່ຄ້າຍຄືກັບຜ້າພົມ.ສໍາລັບເຫດຜົນ, ເນື່ອງຈາກຈໍານວນ enzymes ຫຼາຍເກີນໄປຫຼືຄຸນນະພາບທີ່ບໍ່ດີຂອງ enzyme, ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ dNTP ສູງເກີນໄປ, ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ Mg2+ ແມ່ນສູງເກີນໄປ, ອຸນຫະພູມ annealing ແມ່ນຕ່ໍາເກີນໄປ, ແລະຈໍານວນຂອງຮອບວຽນຫຼາຍເກີນໄປ.ມາດຕະການຕ້ານແມ່ນ: ①ຫຼຸດຜ່ອນປະລິມານຂອງ enzymes, ຫຼືປ່ຽນ enzyme ຂອງແຫຼ່ງອື່ນ.②ຫຼຸດຜ່ອນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ dNTP ③ຫຼຸດຜ່ອນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ Mg2+ ຢ່າງເໝາະສົມ.④​ເພີ່ມ​ປະ​ລິ​ມານ​ຂອງ​ແມ່​ແບບ​ແລະ​ຫຼຸດ​ຜ່ອນ​ຈໍາ​ນວນ​ຂອງ​ຮອບ​ວຽນ​.

ຜະ​ລິດ​ຕະ​ພັນ​ທີ່​ກ່ຽວ​ຂ້ອງ

PCR Heroᵀᴹ (ມີສີຍ້ອມ)

◮ ຄວາມຊື່ສັດທີ່ສູງຂຶ້ນ: 6 ເທົ່າຂອງ enzyme Taq ທໍາມະດາ;

◮ ຄວາມໄວການຂະຫຍາຍໄວຂຶ້ນ

◮ ການປັບຕົວແບບແມ່ແບບເພີ່ມເຕີມ

◮ ປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍທີ່ສູງຂຶ້ນ

◮ ຄວາມທົນທານຕໍ່ສິ່ງແວດລ້ອມແມ່ນແຂງແຮງກວ່າ: ວາງໄວ້ທີ່ 37 ° C ສໍາລັບອາທິດ, ຮັກສາກິດຈະກໍາຫຼາຍກ່ວາ 90%;

◮ ມັນມີກິດຈະກໍາ 5'→ 3' DNA polymerase ແລະ 5'→3' ກິດຈະກໍາ exonuclease, ໂດຍບໍ່ມີກິດຈະກໍາ exonuclease 3'→5'.

PCR Easyᵀᴹ (ມີສີຍ້ອມ)

ລະບົບຕິກິຣິຍາທີ່ເປັນເອກະລັກແລະປະສິດທິພາບສູງ Taq DNA Polymerase ເຮັດໃຫ້ປະຕິກິລິຍາ PCR ມີປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍທີ່ສູງຂຶ້ນ, ຄວາມສະເພາະແລະຄວາມອ່ອນໄຫວ.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (ຂັ້ນຕອນດຽວ)-SYBR Green I

◮ ຊຸດຫນຶ່ງຂັ້ນຕອນເຮັດໃຫ້ການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນແລະ qPCR ສອງປະຕິກິລິຍາຢູ່ໃນທໍ່ດຽວກັນ, ພຽງແຕ່ຕ້ອງການເພີ່ມແມ່ແບບ RNA, primers PCR ສະເພາະແລະ RNase-Free ddH₂O.

◮ ຊຸດສາມາດວິເຄາະ RNA ໄວຣັດ ຫຼື ຕິດຕາມ RNA ໄດ້ໄວ ແລະ ມີປະສິດທິພາບ.

◮ ຊຸດດັ່ງກ່າວໃຊ້ສານປະຕິກິລິຍາທາງລົບຂອງ Foregene ທີ່ເປັນເອກະລັກ ແລະ Foregene HotStar Taq DNA Polymerase ປະສົມປະສານກັບລະບົບຕິກິຣິຍາທີ່ເປັນເອກະລັກເພື່ອປັບປຸງປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍ ແລະ ຄວາມສະເພາະຂອງປະຕິກິລິຍາຢ່າງມີປະສິດທິພາບ.

◮ ລະບົບຕິກິຣິຍາທີ່ດີທີ່ສຸດເຮັດໃຫ້ປະຕິກິລິຍາມີຄວາມອ່ອນໄຫວໃນການກວດຫາທີ່ສູງຂຶ້ນ, ຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງຄວາມຮ້ອນທີ່ແຂງແຮງກວ່າ, ແລະຄວາມທົນທານທີ່ດີກວ່າ.

◮ RT-qPCR ງ່າຍ^TM(ຂັ້ນຕອນຫນຶ່ງ)-SYBR Green I ຊຸດມາພ້ອມກັບສີຍ້ອມຜ້າອ້າງອິງພາຍໃນ ROX, ເຊິ່ງສາມາດນໍາໃຊ້ເພື່ອລົບລ້າງພື້ນຖານຂອງສັນຍານແລະຄວາມຜິດພາດຂອງສັນຍານລະຫວ່າງນ້ໍາດີ, ເຊິ່ງສະດວກສໍາລັບລູກຄ້າໃນການນໍາໃຊ້ອຸປະກອນ PCR ປະລິມານທີ່ແຕກຕ່າງກັນ.

RT ງ່າຍ^TMII (Master Premix ສໍາລັບ ການສັງເຄາະ cDNA ສາຍທໍາອິດສໍາລັບPCR ເວລາຈິງ)

- ຄວາມສາມາດໃນການກໍາຈັດ gDNA ທີ່ມີປະສິດທິພາບ, ເຊິ່ງສາມາດເອົາ gDNA ອອກໃນແມ່ແບບພາຍໃນ 2 ນາທີ.

- ລະບົບການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນທີ່ມີປະສິດທິພາບ, ມັນໃຊ້ເວລາພຽງແຕ່ 15 ນາທີເພື່ອສໍາເລັດການສັງເຄາະ cDNA strand ທໍາອິດ.

- ແມ່ແບບທີ່ຊັບຊ້ອນ: ແມ່ແບບທີ່ມີເນື້ອໃນ GC ສູງແລະໂຄງສ້າງມັດທະຍົມທີ່ສັບສົນຍັງສາມາດຖືກຖອນຄືນດ້ວຍປະສິດທິພາບສູງ.

- ລະບົບການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບຄວາມອ່ອນໄຫວສູງ, ແມ່ແບບລະດັບ pg ສາມາດໄດ້ຮັບ cDNA ທີ່ມີຄຸນນະພາບສູງ.

- ລະ​ບົບ​ການ​ຖອດ​ຖອນ​ຄືນ​ໄດ້​ມີ​ຄວາມ​ຫມັ້ນ​ຄົງ​ຄວາມ​ຮ້ອນ​ສູງ​, ອຸນ​ຫະ​ພູມ​ຕິ​ກິ​ຣິ​ຍາ​ທີ່​ດີ​ທີ່​ສຸດ​ແມ່ນ 42 ℃​, ແລະ​ມັນ​ຍັງ​ມີ​ປະ​ສິດ​ທິ​ພາບ reverse transcription ທີ່​ດີ​ທີ່ 50 ℃​.