ຄ່າ Ct ແມ່ນຮູບແບບການນໍາສະເຫນີຜົນໄດ້ຮັບທີ່ສໍາຄັນທີ່ສຸດຂອງ PCR ປະລິມານ fluorescent.ມັນຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອຄິດໄລ່ຄວາມແຕກຕ່າງຂອງການສະແດງອອກຂອງ gene ຫຼືຈໍານວນການຄັດລອກ gene.ດັ່ງນັ້ນຄ່າ Ct ຂອງ fluorescence quantification ຖືວ່າສົມເຫດສົມຜົນແມ່ນຫຍັງ?ວິທີການຮັບປະກັນລະດັບປະສິດທິຜົນຂອງມູນຄ່າ Ct?
ຄ່າ Ct ແມ່ນຫຍັງ?
ໃນລະຫວ່າງຂະບວນການຂະຫຍາຍ qPCR, ຈໍານວນທີ່ສອດຄ້ອງກັນຂອງວົງຈອນການຂະຫຍາຍ (Cycle Threshold) ໃນເວລາທີ່ສັນຍານ fluorescence ຂອງຜະລິດຕະພັນຂະຫຍາຍໄປຮອດເກນ fluorescence ທີ່ກໍານົດໄວ້.C ຫຍໍ້ມາຈາກ Cycle ແລະ T ຫຍໍ້ມາຈາກ Threshold.ເວົ້າງ່າຍໆ, ຄ່າ Ct ແມ່ນຈໍານວນຂອງຮອບວຽນທີ່ສອດຄ້ອງກັບເວລາທີ່ການຂະຫຍາຍແມ່ແບບເບື້ອງຕົ້ນເຖິງຈໍານວນທີ່ແນ່ນອນຂອງຜະລິດຕະພັນໃນ qPCR.ອັນທີ່ເອີ້ນວ່າ "ຈໍານວນຜະລິດຕະພັນທີ່ແນ່ນອນ" ຈະຖືກອະທິບາຍຕື່ມອີກໃນພາຍຫລັງ.
ຄ່າ Ct ເຮັດຫຍັງ?
1.ຄວາມສຳພັນລະຫວ່າງການຂະຫຍາຍເລກກຳລັງ, ຈຳນວນແມ່ແບບ ແລະຄ່າ Ct
ໂດຍຫລັກການແລ້ວ, ພັນທຸ ກຳ ໃນ qPCR ຖືກສະສົມໂດຍການຂະຫຍາຍຕົວເລກຫຼັງຈາກຮອບວຽນທີ່ແນ່ນອນ.ຄວາມສໍາພັນລະຫວ່າງຈໍານວນຂອງຮອບວຽນຂະຫຍາຍໃຫຍ່ຂື້ນແລະຈໍານວນຜະລິດຕະພັນແມ່ນ: ຈໍານວນຜະລິດຕະພັນຂະຫຍາຍໃຫຍ່ຂື້ນ = ຈໍານວນແມ່ແບບເບື້ອງຕົ້ນ × (1+En) ຈໍານວນຮອບວຽນ.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ປະຕິກິລິຍາ qPCR ແມ່ນບໍ່ສະເຫມີໄປໃນສະຖານະການທີ່ເຫມາະສົມ.ເມື່ອປະລິມານຜະລິດຕະພັນທີ່ຂະຫຍາຍໄປຮອດ "ຈໍານວນຜະລິດຕະພັນທີ່ແນ່ນອນ", ຈໍານວນຂອງຮອບວຽນໃນເວລານີ້ແມ່ນຄ່າ Ct, ແລະມັນຢູ່ໃນໄລຍະເວລາຂະຫຍາຍໃຫຍ່ຂື້ນ.ຄວາມສຳພັນລະຫວ່າງຄ່າ Ct ແລະຈຳນວນຂອງແມ່ແບບເລີ່ມຕົ້ນ: ມີຄວາມສຳພັນເສັ້ນຊື່ລະຫວ່າງຄ່າ Ct ຂອງແມ່ແບບ ແລະ logarithm ຂອງຕົວເລກເລີ່ມຕົ້ນຂອງແມ່ແບບ.ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງແມ່ແບບເບື້ອງຕົ້ນສູງຂຶ້ນ, ຄ່າ Ct ນ້ອຍລົງ;ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງແມ່ແບບເບື້ອງຕົ້ນຕ່ໍາກວ່າ, ຄ່າ Ct ໃຫຍ່ກວ່າ.
2.Amplification curve, ຂອບເຂດ fluorescence ແລະຈໍານວນຜະລິດຕະພັນ PCR ທີ່ແນ່ນອນ
ປະລິມານຂອງຜະລິດຕະພັນຂະຫຍາຍ qPCR ໄດ້ຖືກນໍາສະເຫນີໂດຍກົງໃນຮູບແບບຂອງສັນຍານ fluorescent, ນັ້ນແມ່ນ, ເສັ້ນໂຄ້ງຂະຫຍາຍ.ໃນໄລຍະຕົ້ນຂອງ PCR, ການຂະຫຍາຍແມ່ນຢູ່ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທີ່ເຫມາະສົມ, ຈໍານວນຂອງຮອບວຽນແມ່ນຂະຫນາດນ້ອຍ, ການສະສົມຂອງຜະລິດຕະພັນມີຂະຫນາດນ້ອຍ, ແລະລະດັບຂອງ fluorescence ບໍ່ສາມາດຈໍາແນກຢ່າງຊັດເຈນຈາກພື້ນຖານ fluorescence.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, fluorescence ເພີ່ມຂຶ້ນແລະເຂົ້າສູ່ໄລຍະ exponential.ປະລິມານຂອງຜະລິດຕະພັນ PCR ສາມາດກວດພົບໄດ້ໃນບາງຈຸດໃນເວລາທີ່ປະຕິກິລິຍາ PCR ແມ່ນພຽງແຕ່ຢູ່ໃນໄລຍະ exponential, ເຊິ່ງສາມາດນໍາໃຊ້ເປັນ "ຈໍານວນທີ່ແນ່ນອນຂອງຜະລິດຕະພັນ", ແລະເນື້ອຫາເບື້ອງຕົ້ນຂອງແມ່ແບບສາມາດ deduced ຈາກນີ້.ດັ່ງນັ້ນ, ຄວາມເຂັ້ມຂອງສັນຍານ fluorescence ທີ່ສອດຄ້ອງກັບຈໍານວນທີ່ແນ່ນອນຂອງຜະລິດຕະພັນແມ່ນເກນ fluorescence.
ໃນໄລຍະທ້າຍຂອງ PCR, ເສັ້ນໂຄ້ງການຂະຫຍາຍບໍ່ສະແດງໃຫ້ເຫັນການຂະຫຍາຍຕົວຂະຫຍາຍ, ແລະເຂົ້າສູ່ໄລຍະເສັ້ນຊື່ແລະໄລຍະພູພຽງ.
3.Reproducibility ຂອງຄ່າ Ct
ເມື່ອວົງຈອນ PCR ຮອດຕົວເລກຮອບວຽນຂອງຄ່າ Ct, ມັນໄດ້ເຂົ້າສູ່ໄລຍະການຂະຫຍາຍໂຕເລກທີ່ແທ້ຈິງ.ໃນເວລານີ້, ຄວາມຜິດພາດຂະຫນາດນ້ອຍບໍ່ໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍ, ດັ່ງນັ້ນການແຜ່ພັນຂອງຄ່າ Ct ແມ່ນດີເລີດ, ນັ້ນແມ່ນ, ແມ່ແບບດຽວກັນໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍອອກໃນເວລາທີ່ແຕກຕ່າງກັນຫຼືຢູ່ໃນທໍ່ທີ່ແຕກຕ່າງກັນໃນເວລາດຽວກັນ.ການຂະຫຍາຍ, ຄ່າ Ct ທີ່ໄດ້ຮັບແມ່ນຄົງທີ່.
1.Amplification ປະສິດທິພາບ En
ປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍ PCR ຫມາຍເຖິງປະສິດທິພາບທີ່ໂພລີເມີເຣສປ່ຽນ gene ເພື່ອຂະຫຍາຍເປັນ amplicon.ປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍເມື່ອໂມເລກຸນ DNA ໜ່ວຍໜຶ່ງຖືກປ່ຽນເປັນສອງໂມເລກຸນ DNA ແມ່ນ 100%.ປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍແມ່ນສະແດງອອກໂດຍທົ່ວໄປເປັນ En.ເພື່ອອໍານວຍຄວາມສະດວກໃນການວິເຄາະບົດຄວາມຕໍ່ໄປ, ປັດໃຈທີ່ມີຜົນກະທົບຕໍ່ປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍໄດ້ຖືກແນະນໍາໂດຍຫຍໍ້.
| ປັດໃຈທີ່ມີອິດທິພົນ | ຄໍາອະທິບາຍ | ວິທີການຕັດສິນ? |
| A. ສານຍັບຍັ້ງ PCR | 1. ແມ່ແບບ DNA ມີສານທີ່ຍັບຍັ້ງປະຕິກິລິຢາ PCR ເຊັ່ນ: ທາດໂປຼຕີນຫຼືສານຊັກ.2. cDNA ຫຼັງຈາກການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນປະກອບດ້ວຍຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສູງຂອງອົງປະກອບ reagent ແບບ RNA ຫຼື RT, ເຊິ່ງອາດຈະຍັບຍັ້ງປະຕິກິລິຍາ PCR ຕໍ່ມາ. | 1. ບໍ່ວ່າຈະມີມົນລະພິດສາມາດຖືກຕັດສິນໂດຍການວັດແທກອັດຕາສ່ວນຂອງ A260 / A280 ແລະ A260 / A230 ຫຼື RNA electrophoresis.2. ບໍ່ວ່າຈະເປັນ cDNA ຈະຖືກເຈືອຈາງຕາມອັດຕາສ່ວນທີ່ແນ່ນອນຫຼັງຈາກການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນ. |
| B. ການອອກແບບ primer ທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ | primers ບໍ່ anneal ປະສິດທິພາບ | ກວດເບິ່ງ primers ສໍາລັບ primer-dimers ຫຼື hairpins, ບໍ່ກົງກັນ, ແລະບາງຄັ້ງ spanning intronic designs. |
| C. ການອອກແບບໂຄງການປະຕິກິລິຍາ PCR ທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ | 1. primers ບໍ່ສາມາດ anneal ໄດ້ປະສິດທິພາບ2. ການປ່ອຍ DNA polymerase ບໍ່ພຽງພໍ 3. ອຸນຫະພູມສູງໃນໄລຍະຍາວກິດຈະກໍາ DNA polymerase ຫຼຸດລົງ | 1. ອຸນຫະພູມ annealing ແມ່ນສູງກວ່າຄ່າ TM ຂອງ primer2. ເວລາກ່ອນການເກີດສີດສັ້ນເກີນໄປ 3. ເວລາຂອງແຕ່ລະຂັ້ນຕອນຂອງຂັ້ນຕອນຕິກິຣິຍາແມ່ນຍາວເກີນໄປ |
| D. ການປະສົມບໍ່ພຽງພໍຂອງ reagents ຫຼືຄວາມຜິດພາດ pipetting | ໃນລະບົບຕິກິຣິຍາ, ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທ້ອງຖິ່ນຂອງອົງປະກອບປະຕິກິລິຢາ PCR ແມ່ນສູງເກີນໄປຫຼືບໍ່ສະຫມໍ່າສະເຫມີ, ເຮັດໃຫ້ມີການຂະຫຍາຍທີ່ບໍ່ແມ່ນ exponential ຂອງ PCR amplification. | |
| E. Amplicon ຄວາມຍາວ | ຄວາມຍາວຂອງ amplicon ແມ່ນຍາວເກີນໄປ, ເກີນ 300bp, ແລະປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍແມ່ນຕໍ່າ. | ກວດເບິ່ງວ່າຄວາມຍາວຂອງ amplicon ຢູ່ລະຫວ່າງ 80-300bp |
| F. ອິດທິພົນຂອງ reagents qPCR | ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ DNA polymerase ໃນທາດ reagent ແມ່ນຕໍ່າຫຼືຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ ions ໃນ buffer ບໍ່ໄດ້ຖືກປັບປຸງ, ສົ່ງຜົນໃຫ້ກິດຈະກໍາຂອງ enzyme Taq ບໍ່ເຖິງສູງສຸດ. | ການກໍານົດປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍໂດຍເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານ |
2.Range ຂອງຄ່າ Ct
ຄ່າ Ct ຕັ້ງແຕ່ 15-35.ຖ້າຄ່າ Ct ແມ່ນຫນ້ອຍກວ່າ 15, ມັນຖືວ່າການຂະຫຍາຍຢູ່ໃນຂອບເຂດຂອງໄລຍະເວລາພື້ນຖານແລະຂອບເຂດ fluorescence ຍັງບໍ່ທັນໄດ້ບັນລຸ.ໂດຍຫລັກການແລ້ວ, ມີຄວາມສໍາພັນທາງເສັ້ນລະຫວ່າງຄ່າ Ct ແລະ logarithm ຂອງຈໍານວນສໍາເນົາເບື້ອງຕົ້ນຂອງແມ່ແບບ, ນັ້ນແມ່ນ, ເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານ.ໂດຍຜ່ານເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານ, ເມື່ອປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍແມ່ນ 100%, ຄ່າ Ct ທີ່ຖືກຄິດໄລ່ສໍາລັບການຄິດໄລ່ຈໍານວນສໍາເນົາດຽວຂອງ gene ແມ່ນປະມານ 35. ຖ້າມັນຫຼາຍກວ່າ 35, ຈໍານວນສໍາເນົາເບື້ອງຕົ້ນຂອງແມ່ແບບແມ່ນຫນ້ອຍກວ່າ 1, ເຊິ່ງສາມາດຖືວ່າບໍ່ມີຄວາມຫມາຍ.
ສໍາລັບຊ່ວງ Ct ຂອງ gene ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ, ເນື່ອງຈາກຄວາມແຕກຕ່າງຂອງຈໍານວນການຄັດລອກ gene ແລະປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍໃນຈໍານວນແມ່ແບບເບື້ອງຕົ້ນ, ມັນຈໍາເປັນຕ້ອງເຮັດເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານສໍາລັບ gene ແລະຄິດໄລ່ຂອບເຂດການກວດພົບເສັ້ນຊື່ຂອງ gene.
3.Influencing ປັດໄຈຂອງມູນຄ່າ Ct
ຈາກການພົວພັນລະຫວ່າງຈໍານວນຂອງວົງຈອນການຂະຫຍາຍໃຫຍ່ຂື້ນແລະປະລິມານຂອງຜະລິດຕະພັນ: ຈໍານວນຜະລິດຕະພັນ amplified = ຈໍານວນແມ່ແບບເບື້ອງຕົ້ນ × (1+En) ຈໍານວນຮອບວຽນ, ມັນສາມາດເຫັນໄດ້ວ່າພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທີ່ເຫມາະສົມ, ຈໍານວນແມ່ແບບເບື້ອງຕົ້ນແລະ En ຈະມີຜົນກະທົບທາງລົບຕໍ່ມູນຄ່າ Ct ໄດ້ຮັບຜົນກະທົບ.ຄວາມແຕກຕ່າງຂອງຄຸນນະພາບຂອງແມ່ແບບຫຼືປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍຈະເຮັດໃຫ້ຄ່າ Ct ໃຫຍ່ເກີນໄປຫຼືນ້ອຍເກີນໄປ.
ມູນຄ່າ 4.Ct ແມ່ນໃຫຍ່ເກີນໄປຫຼືນ້ອຍເກີນໄປ
ເວລາປະກາດ: 22-22-2023
