ນຳ

Long non-coding RNA, lncRNA ແມ່ນ RNA ທີ່ບໍ່ແມ່ນລະຫັດທີ່ມີຄວາມຍາວຫຼາຍກວ່າ 200 nucleotides, ໂດຍທົ່ວໄປລະຫວ່າງ 200-100000 nt.lncRNA ຄວບຄຸມການສະແດງອອກຂອງ gene ໃນລະດັບ epigenetic, transcription ແລະ post-transcriptional, ແລະເຂົ້າຮ່ວມໃນ X chromosome silencing, imprinting genome ແລະ chromatin modification, transcription activation, transcription interference, nuclear transport, cell cycle regulation, cell differentiation regulation, and dose comprise effects (Dosageชดเชย ຜົນກະທົບຂອງມະນຸດ) ແລະຂະບວນການອື່ນໆທີ່ມີຄວາມສໍາຄັນຫຼາຍ. ໃນປັດຈຸບັນຫນຶ່ງໃນຈຸດຮ້ອນໃນພາກສະຫນາມຂອງ biomedicine.

01  ປະເພດແລະຄຸນລັກສະນະຂອງ LncRNA

lncRNA ຖືກແບ່ງອອກເປັນຫຼາຍປະເພດຕາມແຫຼ່ງທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງການສ້າງຂອງມັນ, ດັ່ງທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຮູບຂ້າງເທິງ.ມີ​ລັກ​ສະ​ນະ​ດັ່ງ​ຕໍ່​ໄປ​ນີ້​:

1. lncRNAs ປົກກະຕິແລ້ວແມ່ນຍາວກວ່າ, ດ້ວຍການສະແດງອອກແບບເຄື່ອນໄຫວແລະວິທີການ splicing ທີ່ແຕກຕ່າງກັນໃນລະຫວ່າງການແຕກຕ່າງກັນ
2. ເມື່ອປຽບທຽບກັບ coding genes, lncRNA ປົກກະຕິແລ້ວມີລະດັບການສະແດງອອກຕ່ໍາກວ່າ
3. lncRNAs ສ່ວນໃຫຍ່ມີຄວາມສະເພາະທາງດ້ານການສະແດງອອກທາງກາຍ ແລະທາງກວ້າງຂອງພື້ນທີ່ໃນຂະບວນການຂອງຄວາມແຕກຕ່າງ ແລະການພັດທະນາຂອງເນື້ອເຍື່ອ.
4. ມີລັກສະນະສະແດງອອກໃນເນື້ອງອກແລະພະຍາດອື່ນໆ
5. ສະຖານທີ່ຍ່ອຍຂອງ lncRNA ມີຄວາມຫຼາກຫຼາຍ
6. ລໍາດັບມີການອະນຸລັກຕ່ໍາ, ແຕ່ຫນ້າທີ່ມີລະດັບການອະນຸລັກ, ແລະອື່ນໆ.

02 ຄໍາຖາມທີ່ຖາມເລື້ອຍໆກ່ຽວກັບການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບ LncRNA

ເນື່ອງຈາກເນື້ອໃນຕ່ໍາຂອງ lncRNA ໃນຈຸລັງ, ຄວາມຍາວຍາວແລະໂຄງສ້າງລະດັບສູງ, RNA ດັ່ງກ່າວມັກຈະມີໂຄງສ້າງທີ່ຊັບຊ້ອນເຊັ່ນ: ລໍາຕົ້ນຫຼື hairpins, ແລະ RT-qPCR ມີຄວາມສ່ຽງຕໍ່ບັນຫາຂອງການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນທີ່ບໍ່ປະສົບຜົນສໍາເລັດຫຼືປະສິດທິພາບຕໍ່າ.

03 ການແກ້ໄຂການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບ LncRNA

ໃນກົດລະບຽບສູນກາງ, ຂະບວນການຂອງໄວຣັສ RNA ໂດຍໃຊ້ transcriptase ກົງກັນຂ້າມຂອງຕົນເອງເພື່ອສັງເຄາະ DNA ໂດຍໃຊ້ RNA ເປັນແມ່ແບບເອີ້ນວ່າ reverse transcription.ຂະບວນການຂອງການໃຊ້ RNA virus reverse transcriptase ເພື່ອສັງເຄາະ cDNA template ໃນ vitro ເອີ້ນວ່າ reverse transcription.ອົງປະກອບຕົ້ນຕໍລວມຢູ່ໃນລະບົບການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນ: ແບບ RNA, reverse transcriptase, primers ແລະອົງປະກອບອື່ນໆ.

1.RNA ແມ່ແບບ

ອິດທິພົນຂອງແມ່ແບບ RNA ໃນການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນແມ່ນສະທ້ອນໃຫ້ເຫັນໃນໂຄງສ້າງ, ຄວາມບໍລິສຸດແລະຄວາມຊື່ສັດຂອງມັນ.ຄວາມບໍລິສຸດແລະຄວາມສົມບູນຂອງ RNA ທີ່ສະກັດໄດ້ສູງຂຶ້ນ, ປະສິດທິພາບຂອງການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນສູງຂື້ນແລະຄວາມຖືກຕ້ອງຫຼາຍ, ຜົນໄດ້ຮັບໃນປະລິມານຕໍ່ມາ.RNA purified ໂດຍ reagents ການສະກັດເອົາ RNA ທີ່ໃຊ້ທົ່ວໄປມັກຈະມີສານຕົກຄ້າງຂອງເຫຼົ້າແລະເກືອ guanidine, ເຊິ່ງມີຜົນກະທົບ inhibitory ທີ່ເຂັ້ມແຂງກ່ຽວກັບການ reverse transcriptase ຫຼາຍທີ່ສຸດ.

2.Reverse transcriptase

Reverse transcriptase ມີອິດທິພົນທີ່ສໍາຄັນໃນລະບົບການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນທັງຫມົດ.ອຸນ​ຫະ​ພູມ​ທີ່​ເຫມາະ​ສົມ​ສໍາ​ລັບ​ການ reverse transcriptase ທີ່​ນໍາ​ໃຊ້​ໃນ​ຫ້ອງ​ທົດ​ລອງ​ຫຼາຍ​ທີ່​ສຸດ​ໂດຍ​ທົ່ວ​ໄປ​ແມ່ນ 42°C​.ໃນຄວາມເປັນຈິງ, ການເປີດໂຄງສ້າງ RNA ລະດັບສູງຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີອຸນຫະພູມທີ່ສູງຂຶ້ນ, ແລະຄວາມຕ້ອງການສໍາລັບ reverse transcriptase ແມ່ນສູງກວ່າ.

3.primer

ການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບ primers ປະກອບມີ primers ສະເພາະພັນທຸກໍາ, primers random ແລະ primers Oligo dT.lncRNAs ສ່ວນໃຫຍ່ບໍ່ມີຫາງ polyA, ແລະມັນເປັນສິ່ງສໍາຄັນທີ່ຈະຈັບຄູ່ primers random ກັບ Oligo dT.

4.ອົງປະກອບອື່ນໆ

ໃນທັດສະນະຂອງຄວາມຈິງທີ່ວ່າ RNA ແມ່ນງ່າຍຕໍ່ການຍ່ອຍສະຫຼາຍ, ການນໍາສະເຫນີອົງປະກອບໃນລະບົບການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນສາມາດຖືກຫຼຸດລົງ, ເຊິ່ງສາມາດປ້ອງກັນການເຂົ້າມາຂອງ RNase ໄດ້ຢ່າງມີປະສິດທິພາບແລະຮັບປະກັນຄວາມກ້າວຫນ້າຂອງ transcription ລຽບ.

Foregeneໄດ້​ຮັບ​ຈາກ​ແມ່​ແບບ RNA​, reverse transcription ກັບ qPCR​

ຄຸ້ມຄອງການກວດສອບ lncRNA ຂອງທ່ານຢ່າງຄົບຖ້ວນ

ສັດທັງໝົດ RNA Iຜ່ອນຜັນຊຸດ (ມີຖັນກໍາຈັດ gDNA)

ເຊລທັງໝົດ RNA Iຜ່ອນຜັນຊຸດ (ມີຖັນກໍາຈັດ gDNA)

Lnc-RT HeroTM I(With gDNase)(Super Premix ສຳລັບການສັງເຄາະ cDNA ສາຍທຳອິດຈາກ lncRNA)

ເວລາຈິງ PCR EasyTM-SYBR Green I

Aຂໍ້ດີ ofການສະກັດເອົາ RNA:

ຊຸດດັ່ງກ່າວໃຊ້ເທກໂນໂລຍີການສະກັດເອົາ RNA ຮຸ່ນທີສາມ, ບໍ່ຈໍາເປັນຕ້ອງໃຊ້ DNase.

11 ນາທີຈາກ 96, 24, 12, ແລະ 6 ເຊລທີ່ປູກຝັງແຜ່ນດີ, ການສະກັດເອົາປະສິດທິພາບສູງຂອງຈຸລັງ RNA ທີ່ບໍ່ມີ gDNA, ຄວາມບໍລິສຸດສູງ, ມີຄຸນນະພາບສູງ.

ຂໍ້ໄດ້ປຽບຂອງ lncRNA reverse transcription:

ລະບົບການຖອດຂໍ້ຄວາມແບບປີ້ນກັບກັນທີ່ຖືກພັດທະນາໂດຍສະເພາະສໍາລັບ LncRNA ເພື່ອເອົາການປົນເປື້ອນ DNA genomic ຢ່າງໄວວາ.

ລະ​ບົບ​ການ​ຖອດ​ຄວາມ​ປີ້ນ​ກັບ​ຄວາມ​ສະ​ຖຽນ​ລະ​ພາບ​ຄວາມ​ຮ້ອນ​ສູງ​ແລະ​ຍັງ​ມີ​ປະ​ສິດ​ທິ​ພາບ​ການ​ຖອດ​ຖອນ​ຄືນ​ໄດ້​ທີ່​ດີ​ທີ່ 50°C​.

ແມ່ແບບທີ່ມີເນື້ອໃນ GC ສູງແລະໂຄງສ້າງມັດທະຍົມທີ່ສັບສົນສາມາດຖືກຖອນຄືນດ້ວຍປະສິດທິພາບສູງ.

ຂໍ້ດີof qPCR:

ເລີ່ມຕົ້ນຮ້ອນ Foregene Taq Polymerase ມີປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍທີ່ສູງຂຶ້ນ, ຄວາມອ່ອນໄຫວຂອງການຂະຫຍາຍທີ່ສູງຂຶ້ນ, ແລະຄວາມສະເພາະຂອງການຂະຫຍາຍທີ່ສູງຂຶ້ນ

ການເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງ Real PCR Easy Mix ເຮັດໃຫ້ SYBR Green I ມີຄວາມອ່ອນໄຫວໃນການກວດສອບທີ່ສູງຂຶ້ນ, ແລະຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ fluorescence ຂອງມັນແມ່ນ 3-5 ເທົ່າຂອງຜະລິດຕະພັນທີ່ຄ້າຍຄືກັນ, ເຊິ່ງສາມາດຕອບສະຫນອງຄວາມຕ້ອງການຂອງການທົດລອງປະລິມານ fluorescence ປະເພດຕ່າງໆ.