ເຕັກໂນໂລຍີການວິນິດໄສໂມເລກຸນໃຊ້ວິທີການຊີວະວິທະຍາໂມເລກຸນເພື່ອກວດພົບການສະແດງອອກແລະໂຄງສ້າງຂອງສານພັນທຸກໍາຂອງຮ່າງກາຍຂອງມະນຸດແລະເຊື້ອພະຍາດຕ່າງໆ, ເພື່ອບັນລຸຈຸດປະສົງຂອງການຄາດຄະເນແລະການວິນິດໄສພະຍາດ.

ໃນຊຸມປີມໍ່ໆມານີ້, ດ້ວຍການຍົກລະດັບແລະ iteration ຂອງເຕັກໂນໂລຊີການວິນິດໄສໂມເລກຸນ, ການນໍາໃຊ້ທາງດ້ານການຊ່ວຍຂອງການວິນິດໄສໂມເລກຸນໄດ້ກາຍເປັນຫຼາຍແລະກວ້າງຂວາງແລະເລິກ, ແລະຕະຫຼາດການວິນິດໄສໂມເລກຸນໄດ້ເຂົ້າສູ່ໄລຍະເວລາຂອງການພັດທະນາຢ່າງໄວວາ.

ຜູ້ຂຽນໄດ້ສະຫຼຸບກ່ຽວກັບເຕັກໂນໂລຢີການວິນິດໄສໂມເລກຸນທົ່ວໄປໃນຕະຫຼາດ, ແລະແບ່ງອອກເປັນສາມສ່ວນ: ພາກສ່ວນທໍາອິດແນະນໍາເຕັກໂນໂລຢີ PCR, ພາກທີສອງແນະນໍາເຕັກໂນໂລຢີການຂະຫຍາຍອາຊິດນິວຄລີອິກ isothermal amplification, ແລະສ່ວນທີສອງແນະນໍາເຕັກໂນໂລຢີການຂະຫຍາຍລໍາດັບ.

01

ພາກທີ I: PCR Technology

ເທັກໂນໂລຍີ PCR

PCR (ຕິ​ກິ​ຣິ​ຍາ​ຕ່ອງ​ໂສ້ polymerase​) ແມ່ນ​ຫນຶ່ງ​ໃນ​ເຕັກ​ໂນ​ໂລ​ຊີ​ການ​ຂະ​ຫຍາຍ DNA ໃນ vitro​, ມີ​ປະ​ຫວັດ​ສາດ​ຂອງ​ຫຼາຍ​ກ​່​ວາ 30 ປີ​.

ເທັກໂນໂລຍີ PCR ໄດ້ຖືກບຸກເບີກໃນປີ 1983 ໂດຍ Kary Mullis ຈາກ Cetus, ສະຫະລັດອາເມລິກາ.Mullis ໄດ້ຍື່ນຂໍສິດທິບັດ PCR ໃນປີ 1985 ແລະໄດ້ພິມເຜີຍແຜ່ເອກະສານທາງວິຊາການ PCR ທໍາອິດກ່ຽວກັບວິທະຍາສາດໃນປີດຽວກັນ.Mullis ໄດ້ຮັບລາງວັນ Nobel ສາຂາເຄມີໃນປີ 1993.

ຫຼັກການພື້ນຖານຂອງ PCR

PCR ສາມາດຂະຫຍາຍຊິ້ນສ່ວນ DNA ເປົ້າໝາຍໄດ້ຫຼາຍກວ່າໜຶ່ງລ້ານເທື່ອ.ຫຼັກການແມ່ນວ່າພາຍໃຕ້ການ catalysis ຂອງ DNA polymerase, DNA strand ຂອງພໍ່ແມ່ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນແມ່ແບບ, ແລະ primer ສະເພາະແມ່ນໃຊ້ເປັນຈຸດເລີ່ມຕົ້ນສໍາລັບການຂະຫຍາຍ.ມັນໄດ້ຖືກ replicated ໃນ vitro ໂດຍຜ່ານຂັ້ນຕອນເຊັ່ນ: denaturation, annealing, ແລະການຂະຫຍາຍ.ຂະບວນການຂອງລູກສາວ strand DNA ເສີມກັບແມ່ແບບ DNA strand ຂອງພໍ່ແມ່.

ຂະບວນການ PCR ມາດຕະຖານແບ່ງອອກເປັນສາມຂັ້ນຕອນ:

1. Denaturation: ໃຊ້ອຸນຫະພູມສູງເພື່ອແຍກ DNA double strands.ພັນທະບັດໄຮໂດຣເຈນລະຫວ່າງສາຍ DNA ສອງສາຍຖືກແຍກຢູ່ໃນອຸນຫະພູມສູງ (93-98 ° C).

2. ການເນລະມິດ: ຫຼັງຈາກ DNA ເສັ້ນຄູ່ຖືກແຍກອອກ, ອຸນຫະພູມຈະຫຼຸດລົງເພື່ອໃຫ້ primer ສາມາດຜູກມັດກັບ DNA ສາຍດຽວ.

3. ການຂະຫຍາຍ: DNA polymerase ເລີ່ມສັງເຄາະ strands ເສີມຕາມສາຍ DNA ຈາກ primers ຜູກມັດເມື່ອອຸນຫະພູມຫຼຸດລົງ.ໃນເວລາທີ່ການຂະຫຍາຍໄດ້ຖືກສໍາເລັດ, ວົງຈອນແມ່ນສໍາເລັດ, ແລະຈໍານວນຂອງຊິ້ນ DNA ເພີ່ມຂຶ້ນສອງເທົ່າ.

Reciprocating ສາມຂັ້ນຕອນເຫຼົ່ານີ້ 25-35 ເທື່ອ, ຈໍານວນຂອງຊິ້ນ DNA ຈະເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ.

ຄວາມສະຫລາດຂອງ PCR ແມ່ນວ່າ primers ທີ່ແຕກຕ່າງກັນສາມາດຖືກອອກແບບມາສໍາລັບ genes ເປົ້າຫມາຍທີ່ແຕກຕ່າງກັນ, ດັ່ງນັ້ນຊິ້ນສ່ວນ gene ເປົ້າຫມາຍສາມາດຂະຫຍາຍໄດ້ໃນໄລຍະເວລາສັ້ນໆ.

ມາຮອດປະຈຸ, PCR ສາມາດແບ່ງອອກເປັນສາມປະເພດ, ຄື PCR ທໍາມະດາ, PCR ປະລິມານ fluorescent ແລະ PCR ດິຈິຕອນ.

ຮຸ່ນທໍາອິດຂອງ PCR ທໍາມະດາ

ໃຊ້ເຄື່ອງມືຂະຫຍາຍ PCR ທໍາມະດາເພື່ອຂະຫຍາຍພັນທຸກໍາເປົ້າຫມາຍ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນນໍາໃຊ້ agarose gel electrophoresis ເພື່ອກວດຫາຜະລິດຕະພັນ, ພຽງແຕ່ການວິເຄາະຄຸນນະພາບສາມາດເຮັດໄດ້.

ຂໍ້ເສຍຫຼັກຂອງ PCR ຮຸ່ນທໍາອິດ:

- ສ່ຽງຕໍ່ການຂະຫຍາຍທີ່ບໍ່ສະເພາະ ແລະຜົນໄດ້ຮັບໃນທາງບວກທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ.

- ການ​ກວດ​ພົບ​ໃຊ້​ເວ​ລາ​ດົນ​ນານ​ແລະ​ການ​ດໍາ​ເນີນ​ງານ​ແມ່ນ cumbersome​.

- ພຽງ​ແຕ່​ການ​ທົດ​ສອບ​ຄຸນ​ນະ​ພາບ​ທີ່​ສາ​ມາດ​ເຮັດ​ໄດ້​.

PCR ປະລິມານ fluorescence ລຸ້ນທີສອງ

Fluorescence quantitative PCR (Real-Time PCR), ເຊິ່ງເອີ້ນກັນວ່າ qPCR, ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອຕິດຕາມກວດກາການສະສົມຂອງຜະລິດຕະພັນຂະຫຍາຍໃຫຍ່ຂື້ນໂດຍຜ່ານການສະສົມຂອງສັນຍານ fluorescent ໂດຍການເພີ່ມ probes fluorescent ທີ່ສາມາດຊີ້ບອກຄວາມຄືບຫນ້າຂອງລະບົບຕິກິຣິຍາ, ແລະຕັດສິນຜົນໄດ້ຮັບໂດຍຜ່ານເສັ້ນໂຄ້ງ fluorescence, ແລະມັນສາມາດເປັນເສັ້ນໂຄ້ງຂອງມູນຄ່າແລະມາດຕະຖານ.

ເນື່ອງຈາກວ່າເທກໂນໂລຍີ qPCR ດໍາເນີນຢູ່ໃນລະບົບປິດ, ຄວາມເປັນໄປໄດ້ຂອງການປົນເປື້ອນແມ່ນຫຼຸດລົງ, ແລະສັນຍານ fluorescence ສາມາດຕິດຕາມການກວດສອບປະລິມານໄດ້, ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງທີ່ສຸດໃນການປະຕິບັດທາງດ້ານການຊ່ວຍແລະໄດ້ກາຍເປັນເຕັກໂນໂລຢີທີ່ເດັ່ນຊັດໃນ PCR.

ສານ fluorescent ທີ່ໃຊ້ໃນ PCR ປະລິມານ fluorescent ໃນເວລາຈິງສາມາດແບ່ງອອກເປັນ: TaqMan fluorescent probes, molecular beacons ແລະ fluorescent dyes.

1) TaqMan fluorescent probe:

ໃນລະຫວ່າງການຂະຫຍາຍ PCR, ການສືບສວນ fluorescent ສະເພາະຈະຖືກເພີ່ມໃນຂະນະທີ່ເພີ່ມຄູ່ primers.ການສືບສວນແມ່ນ oligonucleotide, ແລະສອງສົ້ນແມ່ນຕິດສະຫຼາກຕາມລໍາດັບດ້ວຍກຸ່ມ fluorescent ນັກຂ່າວແລະກຸ່ມ fluorescent quencher.

ໃນເວລາທີ່ probe ແມ່ນ intact, ສັນຍານ fluorescent emitted ໂດຍກຸ່ມນັກຂ່າວໄດ້ຖືກດູດຊຶມໂດຍກຸ່ມ quenching;ໃນລະຫວ່າງການຂະຫຍາຍ PCR, ກິດຈະກໍາ exonuclease 5′-3′ ຂອງ Taq enzymes cleaves ແລະ degrades probe, ເຮັດໃຫ້ກຸ່ມ fluorescent ນັກຂ່າວແລະ quencher ກຸ່ມ fluorescent ຖືກແຍກອອກ, ດັ່ງນັ້ນລະບົບຕິດຕາມກວດກາ fluorescence ສາມາດໄດ້ຮັບສັນຍານ fluorescence, ນັ້ນແມ່ນ, ທຸກໆຄັ້ງທີ່ DNA strand fluorescent ຖືກຂະຫຍາຍອອກ, ຮູບແບບຂອງ fluorescent ແມ່ນການຂະຫຍາຍສັນຍານ. synchronized ຢ່າງສົມບູນກັບການສ້າງຕັ້ງຂອງຜະລິດຕະພັນ PCR.

2) ສີຍ້ອມສີ SYBR fluorescent:

ໃນລະບົບປະຕິກິລິຢາ PCR, ມີສ່ວນເກີນຂອງສີຍ້ອມ SYBR fluorescent ຖືກເພີ່ມ.ຫຼັງຈາກສີຍ້ອມ SYBR fluorescent ບໍ່ຖືກລວມເຂົ້າກັບສາຍ DNA ສອງຢ່າງໂດຍສະເພາະ, ມັນປ່ອຍສັນຍານ fluorescent.ໂມເລກຸນສີຍ້ອມ SYBR ທີ່ບໍ່ໄດ້ລວມຢູ່ໃນລະບົບຕ່ອງໂສ້ຈະບໍ່ປ່ອຍສັນຍານ fluorescent ໃດໆ, ດັ່ງນັ້ນການຮັບປະກັນສັນຍານ fluorescent ການເພີ່ມຂື້ນຂອງຜະລິດຕະພັນ PCR ແມ່ນ synchronized ຢ່າງສົມບູນກັບການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງຜະລິດຕະພັນ PCR.SYBR ພຽງແຕ່ຜູກມັດກັບ DNA ຄູ່, ດັ່ງນັ້ນເສັ້ນໂຄ້ງການລະລາຍສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກໍານົດວ່າປະຕິກິລິຍາ PCR ແມ່ນສະເພາະ.

3) ໂມເລກຸນ beacons

ມັນແມ່ນເຄື່ອງສຳຫລວດ oligonucleotide ທີ່ມີປ້າຍກຳກັບສອງວົງ stem-loop ທີ່ປະກອບເປັນໂຄງສ້າງຂອງ hairpin ປະມານ 8 ຖານຢູ່ປາຍ 5 ແລະ 3.ລໍາດັບອາຊິດນິວຄລີອິກຢູ່ທັງສອງສົ້ນໄດ້ຖືກຈັບຄູ່ກັນ, ເຮັດໃຫ້ກຸ່ມ fluorescent ແລະກຸ່ມ quenching ແຫນ້ນ.ປິດ, ມັນຈະບໍ່ຜະລິດ fluorescence.

ຫຼັງຈາກຜະລິດຕະພັນ PCR ຖືກສ້າງຂຶ້ນ, ໃນລະຫວ່າງການຂະບວນການຫມູນວຽນ, ສ່ວນກາງຂອງ beacon ໂມເລກຸນຖືກຈັບຄູ່ກັບລໍາດັບ DNA ສະເພາະ, ແລະ gene fluorescent ຖືກແຍກອອກຈາກ gene quencher ເພື່ອຜະລິດ fluorescence.

ຂໍ້ເສຍຫຼັກຂອງ PCR ຮຸ່ນທີສອງ:

ຄວາມອ່ອນໄຫວຍັງຂາດ, ແລະການກວດຫາຕົວຢ່າງທີ່ເຮັດສໍາເນົາຕໍ່າແມ່ນບໍ່ຖືກຕ້ອງ.

ມີອິດທິພົນມູນຄ່າພື້ນຖານ, ແລະຜົນໄດ້ຮັບແມ່ນມີຄວາມອ່ອນໄຫວຕໍ່ການແຊກແຊງ.

PCR ດິຈິຕອນຮຸ່ນທີສາມ

ດິຈິຕອລ PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) ຄິດໄລ່ຈໍານວນສໍາເນົາຂອງລໍາດັບເປົ້າຫມາຍໂດຍຜ່ານການກວດສອບຈຸດສິ້ນສຸດ, ແລະສາມາດປະຕິບັດການກວດສອບປະລິມານຢ່າງແທ້ຈິງທີ່ຖືກຕ້ອງໂດຍບໍ່ຕ້ອງໃຊ້ການຄວບຄຸມພາຍໃນແລະເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານ.

Digital PCR ໃຊ້ການກວດສອບຈຸດສິ້ນສຸດແລະບໍ່ຂຶ້ນກັບຄ່າ Ct (ຮອບວຽນ), ດັ່ງນັ້ນຕິກິຣິຍາ PCR ດິຈິຕອນໄດ້ຮັບຜົນກະທົບຫນ້ອຍໂດຍປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍ, ແລະຄວາມທົນທານຕໍ່ PCR ຕິກິຣິຍາ inhibitors ໄດ້ຖືກປັບປຸງ, ມີຄວາມຖືກຕ້ອງສູງແລະການສືບພັນ.

ເນື່ອງຈາກຄຸນລັກສະນະຂອງຄວາມອ່ອນໄຫວແລະຄວາມຖືກຕ້ອງສູງ, ມັນບໍ່ໄດ້ຖືກແຊກແຊງໄດ້ງ່າຍໂດຍ inhibitors ຕິກິຣິຍາ PCR, ແລະມັນສາມາດບັນລຸປະລິມານຢ່າງແທ້ຈິງທີ່ບໍ່ມີຜະລິດຕະພັນມາດຕະຖານ, ເຊິ່ງໄດ້ກາຍເປັນຈຸດຮ້ອນຂອງການຄົ້ນຄວ້າແລະຄໍາຮ້ອງສະຫມັກ.

ອີງຕາມຮູບແບບທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງຫນ່ວຍປະຕິກິລິຍາ, ມັນສາມາດແບ່ງອອກເປັນສາມປະເພດ: ລະບົບ microfluidic, chip ແລະ droplet.