PCR ແມ່ນເຕັກໂນໂລຊີການຂະຫຍາຍອາຊິດນິວຄລີອິກທີ່ໃຊ້ກັນຢ່າງກວ້າງຂວາງທີ່ສຸດແລະຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງເນື່ອງຈາກຄວາມອ່ອນໄຫວແລະຄວາມສະເພາະຂອງມັນ.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, PCR ຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີການຕົກແຕ່ງຄວາມຮ້ອນຊ້ໍາຊ້ອນແລະບໍ່ສາມາດກໍາຈັດຂໍ້ຈໍາກັດຂອງການອີງໃສ່ເຄື່ອງມືແລະອຸປະກອນ, ເຊິ່ງຈໍາກັດການນໍາໃຊ້ຂອງມັນໃນການທົດສອບທາງດ້ານການຊ່ວຍ.

ນັບຕັ້ງແຕ່ຕົ້ນຊຸມປີ 1990, ຫ້ອງທົດລອງຈໍານວນຫຼາຍໄດ້ເລີ່ມພັດທະນາເຕັກໂນໂລຢີການຂະຫຍາຍອຸນຫະພູມຄົງທີ່ທີ່ບໍ່ຈໍາເປັນຕ້ອງມີການລະບາຍຄວາມຮ້ອນ.ໃນປັດຈຸບັນພວກເຂົາເຈົ້າໄດ້ພັດທະນາເຕັກໂນໂລຊີການຂະຫຍາຍ isothermal loop-mediated, ເຕັກໂນໂລຊີການຂະຫຍາຍ isothermal ທົດແທນ, ເຕັກໂນໂລຊີການຂະຫຍາຍ isothermal ວົງມ້ວນ, ແລະການຂຶ້ນກັບລໍາດັບອາຊິດ nucleic.ເຕັກ​ໂນ​ໂລ​ຊີ​ຂະ​ຫຍາຍ Isothermal ແລະ​ເຕັກ​ໂນ​ໂລ​ຊີ​ອື່ນໆ​. 

Loop-mediated isothermal amplification

ຫຼັກການການຂະຫຍາຍແມ່ນອີງໃສ່ຄວາມຈິງທີ່ວ່າ DNA ຢູ່ໃນສະພາບສົມດຸນແບບເຄື່ອນໄຫວຢູ່ທີ່ປະມານ 65 ° C.ເມື່ອ primer ໃດຖືກຈັບຄູ່ກັບຖານແລະຂະຫຍາຍໄປສູ່ສ່ວນເສີມຂອງ DNA ທີ່ມີສາຍສອງ, ສາຍອື່ນໆຈະແຕກແຍກແລະກາຍເປັນສາຍດຽວ.

ໃນອຸນຫະພູມນີ້, DNA ໃຊ້ 4 primers ສະເພາະເພື່ອອີງໃສ່ DNA polymerase strand-displacement ເພື່ອເຮັດໃຫ້ການສັງເຄາະຂອງ strand-displacement DNA ຕົນເອງໄຫຼວຽນຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ.

ທໍາອິດກໍານົດ 6 ພາກພື້ນສະເພາະ F3, F2, F1, B1, B2, B3 ກ່ຽວກັບ gene ເປົ້າຫມາຍ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນອອກແບບ 4 primers ໂດຍອີງໃສ່ 6 ພາກພື້ນສະເພາະເຫຼົ່ານີ້ (ດັ່ງທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຮູບຂ້າງລຸ່ມນີ້):

primer ຊັ້ນໃນຂ້າງຫນ້າ (FIP) ແມ່ນປະກອບດ້ວຍ F1c ແລະ F2.

primer ດ້ານໃນດ້ານຫລັງ (BIP) ແມ່ນປະກອບດ້ວຍ B1c ແລະ B2, ແລະ TTTT ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນ spacer ກາງ.

primers ຊັ້ນນອກ F3 ແລະ B3 ແມ່ນປະກອບຕາມລໍາດັບຂອງພາກພື້ນ F3 ແລະ B3 ໃນ gene ເປົ້າຫມາຍ.

ໃນລະບົບປະຕິກິລິຍາຂອງ LAMP, ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ primer ພາຍໃນແມ່ນຫຼາຍເທົ່າຂອງ primer ຊັ້ນນອກ.primer ຊັ້ນໃນແມ່ນປະສົມປະສານຄັ້ງທໍາອິດກັບສາຍແມ່ແບບເພື່ອສັງເຄາະສາຍພັນເສີມເພື່ອສ້າງເປັນສາຍສອງ DNA.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, primer ຊັ້ນນອກໄດ້ຖືກລວມເຂົ້າກັບສາຍແມ່ແບບເພື່ອສ້າງເປັນສາຍສອງ DNA.ພາຍໃຕ້ການປະຕິບັດຂອງ BstDNA polymerase, strand ເສີມທີ່ສັງເຄາະໂດຍ primer ພາຍໃນແມ່ນປ່ອຍອອກມາ.ຫຼັງຈາກປະຕິກິລິຍາຫຼາຍໆຢ່າງ, ສາຍພັນທີ່ເສີມສ້າງໃນທີ່ສຸດກໍ່ເປັນສາຍ DNA ດຽວທີ່ມີໂຄງສ້າງ dumbbell.

ໂຄງສ້າງ dumbbell DNA ສາຍດ່ຽວຕົວມັນເອງຖືກໃຊ້ເປັນແມ່ແບບເພື່ອສ້າງເປັນ DNA ໂຄງສ້າງ stem-loop ໄລຍະຂ້າມຜ່ານທີ່ມີປາຍເປີດ.primers ຊັ້ນໃນແລະຊັ້ນນອກນໍາພາ DNA ໂຄງສ້າງ stem-loop ໄລຍະຂ້າມຜ່ານເພື່ອດໍາເນີນການປະຕິກິລິຍາການຍ້າຍ strand ແລະການຂະຫຍາຍຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ແລະສຸດທ້າຍກໍ່ປະກອບເປັນໂຄງສ້າງຂອງລໍາຕົ້ນທີ່ມີຄວາມຍາວແຕກຕ່າງກັນ.ປະສົມ DNA.

ຂໍ້ດີແລະຂໍ້ເສຍຂອງການຂະຫຍາຍ isothermal ແບບ loop-mediated

ຂໍ້​ດີ​ຂອງ LAMP​:

(1) ປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍສູງ, ເຊິ່ງປະສິດທິພາບສາມາດຂະຫຍາຍ 1-10 ສໍາເນົາຂອງ gene ເປົ້າຫມາຍພາຍໃນ 1h, ແລະປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍແມ່ນ 10-100 ເທົ່າຂອງ PCR ທໍາມະດາ.

(2) ເວລາຕິກິຣິຍາສັ້ນ, ສະເພາະແມ່ນແຂງແຮງ, ແລະບໍ່ຈໍາເປັນຕ້ອງມີອຸປະກອນພິເສດ.

ຂໍ້ບົກຜ່ອງຂອງ LAMP:

(1) ຄວາມຕ້ອງການສໍາລັບ primers ແມ່ນສູງໂດຍສະເພາະ.

(2) ຜະລິດຕະພັນຂະຫຍາຍໃຫຍ່ຂື້ນບໍ່ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການ cloning ແລະ sequencing, ແຕ່ສາມາດນໍາໃຊ້ພຽງແຕ່ສໍາລັບການຕັດສິນ.

(3) ເນື່ອງຈາກຄວາມອ່ອນໄຫວທີ່ເຂັ້ມແຂງຂອງມັນ, ມັນງ່າຍທີ່ຈະປະກອບເປັນ aerosols, ເຮັດໃຫ້ເກີດຜົນບວກທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງແລະຜົນກະທົບຕໍ່ຜົນການທົດສອບ.

Strand displacement amplification

Strand displacement amplification (SDA) ແມ່ນເຕັກນິກການຂະຫຍາຍ DNA isothermal ໃນ vitro ໂດຍອີງໃສ່ປະຕິກິລິຍາ enzymatic ທີ່ສະເຫນີໂດຍນັກວິຊາການອາເມລິກາ Walker ໃນປີ 1992.

ລະບົບພື້ນຖານຂອງ SDA ປະກອບມີ endonuclease ຈໍາກັດ, DNA polymerase ທີ່ມີກິດຈະກໍາການຍ້າຍ strand, ສອງຄູ່ຂອງ primers, dNTPs, ແລະທາດການຊຽມແລະ magnesium ions ແລະລະບົບ buffer.

ຫຼັກການຂອງການຂະຫຍາຍການຍ້າຍ strand ແມ່ນອີງໃສ່ລໍາດັບການຮັບຮູ້ endonuclease ທີ່ຖືກແກ້ໄຂທາງເຄມີຢູ່ໃນທັງສອງສົ້ນຂອງ DNA ເປົ້າຫມາຍ.endonuclease ເປີດຊ່ອງຫວ່າງໃນສາຍ DNA ໃນສະຖານທີ່ຮັບຮູ້ຂອງມັນ, ແລະ DNA polymerase ຂະຫຍາຍຊ່ອງຫວ່າງ 3′ End ແລະທົດແທນສາຍ DNA ຕໍ່ໄປ.

DNA ສາຍດຽວທີ່ຖືກທົດແທນສາມາດຖືກລວມເຂົ້າກັບ primers ແລະຂະຫຍາຍອອກເປັນສາຍສອງໂດຍ DNA polymerase.ຂະບວນການນີ້ແມ່ນຊ້ໍາກັນຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ດັ່ງນັ້ນລໍາດັບເປົ້າຫມາຍໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍອອກຢ່າງມີປະສິດທິພາບ.

ຂໍ້ດີແລະຂໍ້ເສຍຂອງເທກໂນໂລຍີ amplification displacement strand

ຂໍ້​ດີ​ຂອງ SDA​:

ປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍແມ່ນສູງ, ເວລາຕິກິຣິຍາສັ້ນ, ສະເພາະແມ່ນແຂງແຮງ, ແລະບໍ່ຈໍາເປັນຕ້ອງມີອຸປະກອນພິເສດ.

ຂໍ້ບົກຜ່ອງຂອງ SDA:

ຜະລິດຕະພັນບໍ່ເປັນເອກະພາບ, ແລະບາງຜະລິດຕະພັນທີ່ມີສາຍດຽວແລະສອງສາຍແມ່ນຜະລິດຢູ່ໃນວົງຈອນ SDA ສະເຫມີ, ແລະການຫາງຈະເກີດຂຶ້ນຢ່າງຫຼີກລ່ຽງເມື່ອກວດພົບໂດຍ electrophoresis.

Rການຂະຫຍາຍວົງມົນ olling

ການຂະຫຍາຍວົງກົມມ້ວນ (RCA) ໄດ້ຖືກສະເຫນີໂດຍການແຕ້ມຮູບກ່ຽວກັບວິທີການຄັດລອກ DNA ຈາກສິ່ງມີຊີວິດທີ່ເປັນພະຍາດໂດຍການມ້ວນວົງ.ມັນ​ຫມາຍ​ເຖິງ​ການ​ນໍາ​ໃຊ້​ຂອງ DNA ວົງ​ສາຍ​ດຽວ​ເປັນ​ແມ່​ແບບ​ໃນ​ອຸນ​ຫະ​ພູມ​ຄົງ​ທີ່​, ແລະ DNA polymerase ພິ​ເສດ (ເຊັ່ນ​: Phi29​) ພາຍ​ໃຕ້​ການ​ປະ​ຕິ​ບັດ​ຂອງ​ການ​ສັງ​ເຄາະ DNA ວົງ​ມ້ວນ​ເພື່ອ​ບັນ​ລຸ​ການ​ຂະ​ຫຍາຍ​ຕົວ​ຂອງ gene ເປົ້າ​ຫມາຍ​.

RCA ສາມາດແບ່ງອອກເປັນການຂະຫຍາຍເສັ້ນ ແລະ ການຂະຫຍາຍເລກກຳລັງ.ປະສິດທິພາບຂອງ Linear RCA ສາມາດບັນລຸ 10⁵ເວລາ, ແລະປະສິດທິພາບຂອງ exponential RCA ສາມາດບັນລຸ 10⁹ເທື່ອ.

ຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ງ່າຍດາຍ, ດັ່ງທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຮູບຂ້າງລຸ່ມນີ້, ການຂະຫຍາຍເສັ້ນຊື່ a ໃຊ້ພຽງແຕ່ 1 primer, exponential amplification b ມີ 2 primers.

Linear RCA ຍັງເອີ້ນວ່າ RCA primer ດຽວ.primer ຜູກມັດກັບ DNA ວົງແລະຖືກຂະຫຍາຍໂດຍການກະ ທຳ ຂອງ DNA polymerase.ຜະລິດຕະພັນແມ່ນເສັ້ນດ່ຽວເສັ້ນດຽວທີ່ມີຈໍານວນລໍາດັບທີ່ຊ້ໍາກັນຫຼາຍພັນເທົ່າຂອງຄວາມຍາວຂອງ loop ດຽວ.

ນັບຕັ້ງແຕ່ຜະລິດຕະພັນຂອງ RCA ເສັ້ນແມ່ນເຊື່ອມຕໍ່ສະເຫມີກັບ primer ເລີ່ມຕົ້ນ, ການແກ້ໄຂງ່າຍຂອງສັນຍານແມ່ນເປັນປະໂຫຍດທີ່ສໍາຄັນ.

Exponential RCA, ເຊິ່ງເອີ້ນກັນວ່າ Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA), ໃນ exponential RCA, one primer amplifies the RCA product, the second primer hybridizes with the RCA product and expands, and the replacement is already bound to the RCA product The downstream primers expand the strand, and repeat a product extension and replacement RCA.

ຂໍ້ດີແລະຂໍ້ເສຍຂອງການຂະຫຍາຍອາຊິດ nucleic ວົງມ້ວນ

ຂໍ້​ດີ​ຂອງ RCA​:

ຄວາມອ່ອນໄຫວສູງ, ສະເພາະທີ່ດີແລະການດໍາເນີນງານງ່າຍດາຍ.

ຂໍ້ບົກຜ່ອງຂອງ RCA:

ບັນຫາພື້ນຖານໃນລະຫວ່າງການກວດພົບສັນຍານ.ໃນລະຫວ່າງການຕິກິຣິຍາ RCA, ການສືບສວນ padlock ທີ່ບໍ່ມີການໄຫຼວຽນແລະ DNA ຫຼື RNA ຂອງແມ່ແບບຂອງ probe ທີ່ບໍ່ມີການຜູກມັດອາດຈະສ້າງສັນຍານພື້ນຖານບາງຢ່າງ. 

Nການຂະຫຍາຍຕາມລໍາດັບ ucleicacid

ການຂະຫຍາຍຕາມລຳດັບອາຊິດນິວຄລີອິກ (NASBA) ແມ່ນເທັກໂນໂລຢີໃໝ່ທີ່ພັດທະນາບົນພື້ນຖານ PCR.ມັນເປັນການຂະຫຍາຍອາຊິດນິວຄລີອິກຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງແລະ isothermal ນໍາພາໂດຍຄູ່ຂອງ primers ທີ່ມີລໍາດັບສົ່ງເສີມ T7.ເທກໂນໂລຍີສາມາດຂະຫຍາຍແມ່ແບບ RNA ປະມານ 109 ເທື່ອໃນເວລາປະມານ 2 ຊົ່ວໂມງ, ເຊິ່ງສູງກວ່າ 1000 ເທົ່າຂອງວິທີການ PCR ທໍາມະດາແລະບໍ່ຈໍາເປັນຕ້ອງມີອຸປະກອນພິເສດ.

ເທກໂນໂລຍີນີ້ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການວິນິດໄສຢ່າງໄວວາຂອງພະຍາດທັນທີທີ່ມັນປາກົດ, ແລະບໍລິສັດຈໍານວນຫຼາຍໃນປະຈຸບັນໃຊ້ວິທີການນີ້ໃນຊຸດກວດຫາ RNA.

ເຖິງແມ່ນວ່າການຂະຫຍາຍ RNA ຍັງສາມາດໃຊ້ເທກໂນໂລຍີ PCR transcription reverse, NASBA ມີຂໍ້ດີຂອງຕົນເອງ: ມັນສາມາດປະຕິບັດໄດ້ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂອຸນຫະພູມທີ່ຂ້ອນຂ້າງຄົງທີ່, ແລະມັນມີຄວາມຫມັ້ນຄົງແລະຖືກຕ້ອງກວ່າເຕັກໂນໂລຢີ PCR ແບບດັ້ງເດີມ.

ປະຕິກິລິຍາຢູ່ທີ່ 41 ອົງສາເຊນຊຽດແລະຕ້ອງການ AMV (ເຊື້ອໄວຣັສ myeloblastosis ຂອງສັດປີກ) reverse transcriptase, RNase H, T7 RNA polymerase ແລະຄູ່ຂອງ primers ເພື່ອໃຫ້ສໍາເລັດ.

ຂະບວນການຕົ້ນຕໍປະກອບມີ:

primer ຕໍ່ຫນ້າປະກອບດ້ວຍລໍາດັບເສີມຂອງຕົວສົ່ງເສີມ T7.ໃນລະຫວ່າງການຕິກິຣິຍາ, primer ຕໍ່ຫນ້າຜູກມັດກັບສາຍ RNA ແລະຖືກກະຕຸ້ນໂດຍ enzyme AMV ເພື່ອສ້າງເປັນສາຍສອງ DNA-RNA.

RNase H ຍ່ອຍ RNA ໃນສາຍຄູ່ປະສົມແລະຮັກສາ DNA ເສັ້ນດ່ຽວ.

ພາຍໃຕ້ການປະຕິບັດຂອງ primer ປີ້ນກັບກັນແລະ enzyme AMV, DNA double strand ທີ່ປະກອບດ້ວຍລໍາດັບສົ່ງເສີມ T7 ແມ່ນສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນ.

ພາຍໃຕ້ການປະຕິບັດຂອງ T7 RNA polymerase, ຂະບວນການຖ່າຍທອດໄດ້ຖືກສໍາເລັດແລະຈໍານວນ RNA ເປົ້າຫມາຍຖືກຜະລິດ.

ຂໍ້​ດີ​ຂອງ NASBA​:

(1) primer ຂອງມັນມີລໍາດັບການສົ່ງເສີມ T7, ແຕ່ DNA ສອງສາຍຕ່າງປະເທດບໍ່ມີລໍາດັບສົ່ງເສີມ T7 ແລະບໍ່ສາມາດຂະຫຍາຍໄດ້, ດັ່ງນັ້ນເຕັກໂນໂລຢີນີ້ມີຄວາມສະເພາະແລະຄວາມອ່ອນໄຫວສູງ.

(2) NASBA ປະກອບໂດຍກົງກັບຂະບວນການ transcription reverse ເຂົ້າໄປໃນຕິກິຣິຍາ amplification, ຫຍໍ້ເວລາຕິກິຣິຍາ.

ຂໍ້​ເສຍ​ຂອງ NASBA​:

(1) ອົງປະກອບຂອງປະຕິກິລິຍາແມ່ນສັບສົນຫຼາຍ.

(2) ສາມຊະນິດຂອງ enzymes ແມ່ນຕ້ອງການເພື່ອເຮັດໃຫ້ການຕິກິຣິຍາຄ່າໃຊ້ຈ່າຍສູງຂຶ້ນ.