• ເຟສບຸກ
  • ລິ້ງຄ໌
  • youtube

1. ກວດພົບການດູດຊຶມຂອງການແກ້ໄຂ RNA

ການດູດຊຶມຢູ່ທີ່ 280, 320, 230, ແລະ 260 nm ເປັນຕົວແທນຂອງຄ່າຂອງອາຊິດນິວຄລີອິກ, ພື້ນຫລັງ (ຄວາມຂົ້ນຂອງການແກ້ໄຂ), ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງເກືອ, ແລະທາດອິນຊີເຊັ່ນທາດໂປຼຕີນ, ຕາມລໍາດັບ.ໂດຍທົ່ວໄປແລ້ວເບິ່ງພຽງແຕ່ OD260/OD280 (ອັດຕາສ່ວນ, R).ເມື່ອ 1.8 ~ 2.0, ພວກເຮົາຄິດວ່າການປົນເປື້ອນຂອງທາດໂປຼຕີນຫຼືສານອິນຊີອື່ນໆໃນ RNA ສາມາດທົນທານໄດ້, ແຕ່ຄວນສັງເກດວ່າເມື່ອ Tris ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນ buffer ໃນການກວດສອບການດູດຊຶມ, ຄ່າ R ອາດຈະສູງກວ່າ 2 (ໂດຍທົ່ວໄປມັນຄວນຈະເປັນ <2.2).ເມື່ອ R<1.8, ມົນລະພິດຂອງທາດໂປຼຕີນຫຼືສານອິນຊີອື່ນໆໃນການແກ້ໄຂແມ່ນຈະແຈ້ງກວ່າ, ແລະຊະຕາກໍາຂອງ RNA ສາມາດຖືກກໍານົດຕາມຄວາມຕ້ອງການ.ເມື່ອ R> 2.2, ມັນຫມາຍຄວາມວ່າ RNA ໄດ້ຖືກ hydrolyzed ເປັນອາຊິດ nucleic ດຽວ.
 
2.Electrophoretic ຮູບແບບຂອງ RNA
ໂດຍທົ່ວໄປແລ້ວ, gel denaturing ແມ່ນໃຊ້ສໍາລັບ RNA electrophoresis, ແຕ່ຖ້າມັນເປັນພຽງແຕ່ສໍາລັບການກວດສອບຄຸນນະພາບຂອງ RNA, gel denaturing ແມ່ນບໍ່ຈໍາເປັນ, ແລະ gel agarose ທໍາມະດາສາມາດຖືກນໍາໃຊ້.ຈຸດປະສົງຂອງ electrophoresis ແມ່ນເພື່ອກວດຫາຄວາມສົມບູນຂອງແຖບ 28S ແລະ 18S ແລະອັດຕາສ່ວນຂອງເຂົາເຈົ້າ, ຫຼືຄວາມສົມບູນຂອງ mRNA smear.ໂດຍທົ່ວໄປແລ້ວ, ຖ້າແຖບ 28S ແລະ 18S ມີຄວາມສະຫວ່າງ, ຊັດເຈນ, ແລະແຫຼມ (ຫມາຍເຖິງຂອບຂອງແຖບແມ່ນຈະແຈ້ງ), ແລະຄວາມສະຫວ່າງຂອງ 28S ແມ່ນຫຼາຍກວ່າສອງເທົ່າຂອງແຖບ 18S, ພວກເຮົາພິຈາລະນາຄຸນນະພາບຂອງ RNA ແມ່ນດີ.
ຂ້າງເທິງນີ້ແມ່ນສອງວິທີທີ່ພວກເຮົາໃຊ້ທົ່ວໄປ, ແຕ່ທັງສອງວິທີການເຫຼົ່ານີ້ບໍ່ສາມາດບອກພວກເຮົາໄດ້ຢ່າງຊັດເຈນວ່າມີ RNase ຕົກຄ້າງຢູ່ໃນການແກ້ໄຂ RNA.ຖ້າມີຈໍານວນ RNase ຫນ້ອຍຫຼາຍໃນການແກ້ໄຂ, ມັນເປັນການຍາກສໍາລັບພວກເຮົາທີ່ຈະກວດພົບມັນດ້ວຍວິທີຂ້າງເທິງ, ແຕ່ປະຕິກິລິຍາ enzymatic ຕໍ່ມາສ່ວນຫຼາຍແມ່ນດໍາເນີນຢູ່ຂ້າງເທິງ 37 ອົງສາແລະເປັນເວລາດົນນານ.ດ້ວຍວິທີນີ້, ຖ້າມີຈໍານວນ RNase ຫນ້ອຍຫຼາຍໃນການແກ້ໄຂ RNA, ຫຼັງຈາກນັ້ນຈະມີສະພາບແວດລ້ອມທີ່ເຫມາະສົມຫຼາຍແລະເວລາທີ່ຈະມີບົດບາດຂອງພວກເຂົາໃນການທົດລອງຕໍ່ໄປ, ແລະແນ່ນອນວ່າການທົດລອງຈະເຢັນໃນເວລານີ້.ຂ້າງລຸ່ມນີ້ພວກເຮົາແນະນໍາວິທີການທີ່ສາມາດຢືນຢັນວ່າມີ RNase ຕົກຄ້າງຢູ່ໃນການແກ້ໄຂ RNA.
 
3. ການທົດສອບການຮັກສາຄວາມຮ້ອນ
ອີງຕາມຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງຕົວຢ່າງ, ແຕ້ມສອງ 1000 ng RNA ຈາກການແກ້ໄຂ RNA ແລະຕື່ມໃສ່ທໍ່ centrifuge 0.5 ml, ແລະເສີມມັນດ້ວຍ pH 7.0 Tris buffer ກັບປະລິມານທັງຫມົດ 10 ul, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນປະທັບຕາຝາຂອງທໍ່.ເອົາຫນຶ່ງຂອງພວກເຂົາເຂົ້າໄປໃນອາບນ້ໍາອຸນຫະພູມຄົງທີ່ຢູ່ທີ່ 70 ° C ແລະຮັກສາມັນໃຫ້ອົບອຸ່ນສໍາລັບ 1 ຊົ່ວໂມງ.ສ່ວນອື່ນແມ່ນເກັບໄວ້ໃນຕູ້ເຢັນ -20 ອົງສາ C ເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງ.ເມື່ອເວລາເຖິງ, ເອົາສອງຕົວຢ່າງສໍາລັບ electrophoresis.ຫຼັງຈາກ electrophoresis ສໍາເລັດ, ປຽບທຽບແຖບ electrophoretic ຂອງທັງສອງ.ຖ້າແຖບຂອງທັງສອງມີຄວາມສອດຄ່ອງຫຼືບໍ່ມີຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ສໍາຄັນ (ແນ່ນອນ, ແຖບຂອງພວກເຂົາຍັງຕອບສະຫນອງເງື່ອນໄຂໃນວິທີການ 2), ມັນຫມາຍຄວາມວ່າບໍ່ມີການປົນເປື້ອນ RNase ຕົກຄ້າງຢູ່ໃນການແກ້ໄຂ RNA, ແລະຄຸນນະພາບຂອງ RNA ແມ່ນດີຫຼາຍ.ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ຖ້າຕົວຢ່າງ incubated ຢູ່ທີ່ 70 ° C ສະແດງໃຫ້ເຫັນການເຊື່ອມໂຊມຢ່າງຊັດເຈນ, ມັນຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າມີການປົນເປື້ອນ RNase ໃນການແກ້ໄຂ RNA.
 
2 ວິທີການທົດລອງແລະເຕັກນິກການສະກັດເອົາ RNA
ບັນຫາທີ່ພວກເຮົາມັກຈະພົບໃນເວລາທີ່ສະກັດ RNA ແມ່ນ: (1) ຜົນຜະລິດ RNA ແມ່ນຕໍ່າ;(2) RNA ມີມົນລະພິດເກືອທີ່ຮ້າຍແຮງ;(3) RNA ມີມົນລະພິດສານລະລາຍທາງອິນຊີທີ່ຮ້າຍແຮງ;(4) ການເຊື່ອມໂຊມຂອງຕົວຢ່າງແລະບັນຫາອື່ນໆ
 
1. ທົ່ວໄປໃຊ້ສານສະກັດຈາກ RNA ທັງໝົດ
ວິທີການ guanidine isothiocyanate ແລະວິທີການ Trizol ແມ່ນວິທີການທີ່ຖືກນໍາໃຊ້ຫຼາຍທີ່ສຸດສໍາລັບການສະກັດເອົາ RNA ທັງຫມົດອອກຈາກເນື້ອເຍື່ອສັດແລະຈຸລັງສັດ.ມັນເຫມາະສົມໂດຍສະເພາະສໍາລັບຕົວຢ່າງຂະຫນາດນ້ອຍແລະເນື້ອເຍື່ອທີ່ມີຄວາມຫຍຸ້ງຍາກໂດຍສະເພາະໃນການສະກັດ, ເຊັ່ນ: ການສະກັດເອົາ RNA ທັງຫມົດຈາກຜິວຫນັງກະຕ່າຍແລະເນື້ອເຍື່ອເຊື່ອມຕໍ່ສັດ;ນອກຈາກນັ້ນ, Trizol, ເປັນຢາ lysis ຈຸດປະສົງທົ່ວໄປ, ຍັງສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການສະກັດເອົາເນື້ອເຍື່ອພືດ, ເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ, ເຊື້ອລາແລະແພຈຸລັງອື່ນໆ.ສໍາລັບເນື້ອເຍື່ອພືດທີ່ມີ polysaccharides ແລະ polyphenols, ເຊັ່ນ camellia oleifera, ໃບຊາ, rapeseed, ແລະອື່ນໆ, ວິທີການ CTAB ຍັງສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອສະກັດ RNA ທັງຫມົດ.

ໃນຖານະເປັນວິທີການທໍາມະດາ, ວິທີການ double-column ຍັງເປັນທີ່ນິຍົມຫຼາຍເນື່ອງຈາກການດໍາເນີນງານຂອງອຸນຫະພູມປົກກະຕິ, ບໍ່ຈໍາເປັນຕ້ອງເພີ່ມ RNase, ແລະຄວາມປອດໄພ - ບໍ່ມີ chloroform, phenols ແລະທາດປະສົມອິນຊີອື່ນໆສໍາລັບການສະກັດເອົາ.(ຜະລິດຕະພັນແນະນໍາ )

1
2

2. ການສະກັດເອົາ RNA ທັງໝົດອອກຈາກເນື້ອເຍື່ອສັດ
 
(1) ພະຍາຍາມເລືອກເນື້ອເຍື່ອສົດ, ຖ້າມັນບໍ່ສົດ (ມັກພາຍໃນສາມເດືອນ - ຕູ້ເຢັນ 80 ℃ຫຼືແຊ່ແຂງໃນໄນໂຕຣເຈນທີ່ເປັນຂອງແຫຼວ. ໃນເວລາຕັດເນື້ອເຍື່ອ, ຢ່າຕັດໂດຍກົງໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງ, ໃຫ້ແນ່ໃຈວ່າເອົາໃສ່ໃນປ່ອງກ້ອນ, ພະຍາຍາມຫຼີກເວັ້ນການແຊ່ແຂງແລະ thawing ຊ້ໍາຊ້ອນ.
(2) ໃຊ້ມີດຕັດທີ່ສະອາດ ແລະ tweezers ຕັດເນື້ອເຍື່ອຂະຫນາດນ້ອຍ, ພະຍາຍາມຕັດສ່ວນກາງຂອງເນື້ອເຍື່ອໃນເວລາທີ່ຕັດຕົວຢ່າງ, ຫຼືທໍາອິດຕັດເນື້ອເຍື່ອຂະຫນາດໃຫຍ່ຈາກກາງ, ແລ້ວຕັດຕົວຢ່າງທີ່ຕໍາແຫນ່ງ incision ສົດ.ເນື້ອເຍື່ອທີ່ຖອດອອກຄວນຈະຖືກຕັດອອກຢ່າງສົມບູນ, ເອົາເນື້ອເຍື່ອທີ່ແຕກຫັກເຂົ້າໄປໃນທໍ່ EP ໂດຍບໍ່ມີ RNase, ເພີ່ມ lysate, ເນື້ອເຍື່ອ shredded ຄວນໄດ້ຮັບການສໍາຜັດຢ່າງເຕັມທີ່ກັບ lysate, ແລະກະກຽມສໍາລັບການເຮັດໃຫ້ເປັນເນື້ອດຽວກັນ.

(3) ສໍາລັບເນື້ອເຍື່ອປົກກະຕິ, ເລືອກເນື້ອເຍື່ອຖົ່ວເຫຼືອງ, ຖົ່ວເຫຼືອງ (30-60 ມກ) ສໍາລັບການເຮັດໃຫ້ເປັນເນື້ອດຽວກັນ.ຖ້າເນື້ອເຍື່ອປະກອບດ້ວຍທາດໂປຼຕີນ, ໄຂມັນ, ຫຼືເນື້ອເຍື່ອຫນາແຫນ້ນເຊັ່ນ: ຕັບ, ເພີ່ມຫຼືຫຼຸດລົງປະລິມານຂອງເນື້ອເຍື່ອທີ່ຖືກຕັດຢ່າງເຫມາະສົມ (ເລືອກ 10 ~ 20 ມລກ).
(4) ຖ້າກ້າມປາ, ຊີ້ນກຸ້ງ, ວຸ້ນແລະເນື້ອເຍື່ອອື່ນໆທີ່ມີນ້ໍາສູງໄດ້ຖືກສະກັດ, ປະລິມານຕົວຢ່າງຄວນໄດ້ຮັບການເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງເຫມາະສົມ (ແນະນໍາ 100-200 ມລກ).
(5) ຖ້າເງື່ອນໄຂອະນຸຍາດ, ເນື້ອເຍື່ອສັດສາມາດສະກັດໄດ້ໂດຍກົງຫຼັງຈາກຖືກປະສົມກັບເນື້ອເຍື່ອທີ່ແຜ່ຫຼາຍ, ຖ້າບໍ່ມີອຸປະກອນດັ່ງກ່າວ.
(6) RNA ທີ່ໄດ້ຮັບຫຼັງຈາກການສະກັດເອົາສຸດທ້າຍຕ້ອງຖືກໃສ່ໃສ່ກ່ອງກ້ອນທັນທີເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນການເຊື່ອມໂຊມຂອງ RNA.

3. ການສະກັດເອົາ RNA ຂອງເຊນສັດ

(1) ຈຸລັງ Suspension: centrifuge ໂດຍກົງແລະຖິ້ມຂະຫນາດກາງ, ລ້າງດ້ວຍ PBS ທີ່ບໍ່ສະອາດສໍາລັບ 1-2 ເທື່ອ, ຫຼັງຈາກນັ້ນໂຈະດ້ວຍປະລິມານທີ່ເຫມາະສົມຂອງ PBS, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນເພີ່ມ lysate ສໍາລັບ lysis.ຢ່າເພີ່ມ lysate ໂດຍກົງໃສ່ຈຸລັງທີ່ precipitated ຫຼັງຈາກປະຖິ້ມຂອງແຫຼວຢ່າງສົມບູນ.ນີ້ຈະເຮັດໃຫ້ຊຸດ histone ປ່ອຍອອກມາຫຼັງຈາກຈຸລັງ lysed ໃນຊັ້ນນອກຕິດກັບພາຍນອກຂອງຈຸລັງ precipitated, ດັ່ງນັ້ນການຈໍາກັດການຕິດຕໍ່ຂອງຈຸລັງພາຍໃນເມັດທີ່ມີ lysate., ສົ່ງຜົນໃຫ້ lysis ຈຸລັງບໍ່ຄົບຖ້ວນແລະຜົນຜະລິດ RNA ຫຼຸດລົງ.

(2) ຈຸລັງທີ່ຕິດຢູ່ເຄິ່ງຕິດກັນ ຫຼື ບໍ່ຕິດແໜ້ນ: ຫຼັງຈາກຖິ້ມສື່ກາງແລ້ວ, ລ້າງດ້ວຍ PBS 1-2 ເທື່ອ, ຈາກນັ້ນດູດເອົາ PBS ໂດຍກົງໃນປະລິມານທີ່ເໝາະສົມ ແລະ ຟັນແຜ່ນອາຫານດ້ວຍທໍ່ ຫຼື ປືນເພື່ອລະເບີດເຊວອອກ, ແລະ ໂອນໄປສູ່ເຊລທີ່ບໍ່ມີ RNA.ເພີ່ມ lysate ເຂົ້າໄປໃນທໍ່ EP ຂອງ enzyme ສໍາລັບການສະກັດເອົາ.

(3) ຈຸລັງທີ່ຕິດກັນ: ຕ້ອງໄດ້ຮັບການຍ່ອຍສະຫຼາຍດ້ວຍ trypsin ທໍາອິດ, ຫຼັງຈາກນັ້ນເກັບກໍາເຂົ້າໄປໃນທໍ່ RNase-free EP, centrifuged ເພື່ອເອົາ supernatant, ລ້າງ 1-2 ເທື່ອດ້ວຍ PBS ເພື່ອເອົາ trypsin ເກີນ, ແລະ resuspended ດ້ວຍປະລິມານທີ່ເຫມາະສົມຂອງ PBS ຫຼັງຈາກນັ້ນດໍາເນີນການຂັ້ນຕອນການສະກັດເອົາ.

4. ການສະກັດເອົາ RNA ຂອງພືດ

ເນື້ອເຍື່ອຂອງພືດແມ່ນອຸດົມໄປດ້ວຍສານປະກອບ phenolic, ຫຼືອຸດົມສົມບູນໃນ polysaccharides, ຫຼືມີບາງ metabolites ຮອງທີ່ບໍ່ໄດ້ລະບຸ, ຫຼືມີກິດຈະກໍາສູງຂອງ RNase.ສານເຫຼົ່ານີ້ຖືກລວມເຂົ້າກັນຢ່າງແຫນ້ນຫນາກັບ RNA ຫຼັງຈາກ lysis ຈຸລັງເພື່ອສ້າງສະລັບສັບຊ້ອນທີ່ບໍ່ລະລາຍຫຼື precipitates colloidal, ເຊິ່ງຍາກທີ່ຈະເອົາອອກ.ດັ່ງນັ້ນ, ເມື່ອພວກເຮົາສະກັດເນື້ອເຍື່ອພືດ, ພວກເຮົາຈໍາເປັນຕ້ອງເລືອກຊຸດສໍາລັບພືດ.lysate ໃນຊຸດສາມາດແກ້ໄຂບັນຫາການຜຸພັງໄດ້ງ່າຍຂອງ polyphenols ແລະການແຍກທາດປະສົມ polysaccharide ແລະອາຊິດ nucleic.

(ສໍາລັບການສະກັດເອົາ RNA ຂອງພືດ polysaccharide polysaccharide, ຜະລິດຕະພັນແນະນໍາ:

(1) ປອກເປືອກ, ເນື້ອເຍື່ອ, ແກ່ນ, ໃບ, ແລະອື່ນໆຂອງພືດຄວນໄດ້ຮັບການດິນຢ່າງເຕັມສ່ວນໃນ mortar.ໃນລະຫວ່າງການປຸງແຕ່ງ, ໄນໂຕຣເຈນຂອງແຫຼວຄວນໄດ້ຮັບການເຕີມເຕັມໃຫ້ທັນເວລາເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການລະລາຍຂອງຕົວຢ່າງ.ຕົວຢ່າງພື້ນດິນຄວນຖືກເພີ່ມເຂົ້າໄປໃນ lysate ຢ່າງໄວວາແລະສັ່ນສະເທືອນເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການທໍາລາຍ RNA.

(2) ສໍາລັບຕົວຢ່າງທີ່ມີເສັ້ນໄຍເຊັ່ນ: ເຂົ້າແລະໃບເຂົ້າສາລີ, ປະລິມານການສະກັດເອົາຄວນໄດ້ຮັບການຫຼຸດລົງຢ່າງເຫມາະສົມ, ຖ້າບໍ່ດັ່ງນັ້ນການຂັດເນື້ອເຍື່ອແລະ lysis ຈະບໍ່ສົມບູນ, ເຮັດໃຫ້ຜົນຜະລິດຂອງ RNA ທີ່ສະກັດອອກມາຕໍ່າ.

(3) ສໍາລັບເນື້ອເຍື່ອພືດທີ່ມີນ້ໍາຫຼາຍ, ເຊັ່ນ: ຫມາກ pomegranate, ຫມາກໂມ, ຫມາກ peach, ແລະອື່ນໆ, ຂະຫນາດຕົວຢ່າງຄວນໄດ້ຮັບການເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງເຫມາະສົມ (100-200 mg ແມ່ນທາງເລືອກ).

(4) ເນື້ອເຍື່ອຂອງພືດເຊັ່ນ: ໃບພືດ, ຫົວ, ໝາກແຂງ ແລະ ວັດສະດຸອື່ນໆ ໂດຍທົ່ວໄປແມ່ນແນະນຳໃຫ້ໃຊ້ໄນໂຕຣເຈນທີ່ເປັນຂອງແຫຼວຖູສ່ວນປະສົມໃສ່ໃນປູນຢ່າງລະອຽດ, ຈາກນັ້ນ ດຳ ເນີນຂັ້ນຕອນການສະກັດ.ເຄື່ອງປະສົມເນື້ອເຍື່ອແບບດັ້ງເດີມອາດຈະບໍ່ມີປະສິດຕິຜົນໃນການເຮັດໃຫ້ເນື້ອເຍື່ອພືດເປັນຕົວດຽວກັນ, ແລະໂດຍທົ່ວໄປແລ້ວບໍ່ໄດ້ຖືກແນະນຳ.

5. ຂໍ້ຄວນລະວັງໃນການສະກັດ RNA

(1) ຕົວຢ່າງຂອງເນື້ອເຍື່ອຄວນຈະສົດທີ່ສຸດເທົ່າທີ່ຈະເຮັດໄດ້ເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການແຊ່ແຂໍງ ແລະ thawing ຊ້ຳໆ.

(2) ເນື້ອເຍື່ອຄວນຈະເປັນດິນຢ່າງເຕັມທີ່ໃນລະຫວ່າງການສະກັດເອົາ, ແລະປະລິມານຂອງເນື້ອເຍື່ອບໍ່ຄວນຫນ້ອຍເກີນໄປ, ປ່ອຍໃຫ້ຢູ່ຄົນດຽວເກີນໄປ.

(3) ຄວນໃຫ້ເວລາຟອກໃຫ້ພຽງພໍຫຼັງຈາກເພີ່ມ lysate ເພື່ອໃຫ້ lyse ເຕັມຕົວຢ່າງ.

(4) ເມື່ອນໍາໃຊ້ວິທີການສະກັດເອົາ Trizol, ຫຼັກການຂອງການດູດຊຶມ supernatant ຫຼັງຈາກການ stratification ແມ່ນ "ມັກ inhalation ຫນ້ອຍກ່ວາ inhale ຫຼາຍ", ແລະຈະຕ້ອງບໍ່ສະກັດເຖິງຊັ້ນກາງ, ຖ້າບໍ່ດັ່ງນັ້ນມັນຈະເຮັດໃຫ້ເກີດການປົນເປື້ອນ DNA ຂອງ genomic ຮ້າຍແຮງ.

(5) ເມື່ອລ້າງ, ນໍ້າລ້າງຄວນແຊກຊຶມເຂົ້າໄປທົ່ວຝາທໍ່ເພື່ອຮັບປະກັນການລ້າງຢ່າງລະອຽດ.

(6) ສໍາລັບວິທີການສະກັດຖັນ, ນອກເຫນືອຈາກການແຍກຄໍລໍາຫຼັງຈາກການລ້າງ, ຖັນ adsorption ຍັງຄວນຈະຖືກຈັດໃສ່ໃນ bench ທີ່ສະອາດທີ່ສຸດແລະ blown ສໍາລັບ 5-10 ນາທີເພື່ອ evaporate ຢ່າງເຕັມສ່ວນສານລະລາຍອິນຊີໃຫ້ແຫ້ງ.

(7) ໃນຂັ້ນຕອນສຸດທ້າຍຂອງວິທີການຖັນ, ຫຼັງຈາກຕື່ມນ້ໍາ DEPC, ມັນຄວນຈະ incubed ສໍາລັບ 3-5 ນາທີ, ຫຼືນ້ໍາ DEPC ຄວນໄດ້ຮັບຄວາມຮ້ອນເຖິງ 60 ° C ລ່ວງຫນ້າເພື່ອເພີ່ມຜົນຜະລິດ elution.ໃນແບບດັ້ງເດີມ Trizol cleavage ແລະ isopropanol precipitation method, RNA ສຸດທ້າຍຖືກລະລາຍໃນນ້ໍາ DEPC, ສະນັ້ນຄວນຈະໃຫ້ເວລາທີ່ເຫມາະສົມສໍາລັບການລະລາຍ, ແລະດ້ານລຸ່ມຂອງທໍ່ centrifuge ຄວນໄດ້ຮັບການ blown ຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງດ້ວຍປາຍ pipette.

3 ທhree ສາເຫດແລະວິທີແກ້ໄຂສໍາລັບຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນ RNA ຕ່ໍາ / ຄຸນນະພາບທີ່ບໍ່ດີ
 
1. ຜົນຜະລິດຕໍ່າເກີນໄປ
ຕົວຢ່າງທີ່ສະກັດອອກມາແມ່ນຕໍ່າເກີນໄປ, ຈໍານວນທັງຫມົດບໍ່ພຽງພໍ, ຫຼືຕົວຢ່າງທີ່ສະກັດອອກມາແມ່ນຫຼາຍເກີນໄປແລະ lysis ບໍ່ສົມບູນ;ເນື້ອເຍື່ອຫຼືຈຸລັງທີ່ມີຄຸນນະພາບທີ່ເຫມາະສົມຄວນຈະຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການສະກັດເອົາ, ການປິ່ນປົວເບື້ອງຕົ້ນຂອງຕົວຢ່າງຕ້ອງເຮັດໄດ້ດີ, ແລະ lysis ຄວນຈະພຽງພໍ.
 
2. ສານຕົກຄ້າງຂອງ Genome
ເມື່ອສະກັດດ້ວຍວິທີ Trizol, ເມື່ອ supernatant ຖືກດູດເຂົ້າໄປໃນຊັ້ນກາງຫຼັງຈາກຊັ້ນ, ການປົນເປື້ອນຂອງ genome ຮ້າຍແຮງຈະເກີດ;ຄວນລະມັດລະວັງເປັນພິເສດໃນເວລາທີ່ການວາງຊັ້ນເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການດູດເຂົ້າໄປໃນຊັ້ນກາງ.ຖ້າວິທີການຂອງຖັນຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການສະກັດເອົາ, ຊຸດທີ່ມີ DNase I ສາມາດຖືກເລືອກສໍາລັບການສະກັດເອົາ.ອາຊິດນິວຄລີອິກທີ່ດູດຊຶມຢູ່ເທິງເຍື່ອແມ່ນຖືກຍ່ອຍໂດຍກົງດ້ວຍ DNase I, ເຊິ່ງສາມາດຫຼຸດຜ່ອນການຕົກຄ້າງຂອງ DNA ໄດ້ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ.
 
3. ການເຊື່ອມໂຊມຂອງ RNA
ມັນອາດຈະເປັນການເຊື່ອມໂຊມຂອງຕົວຢ່າງທີ່ສະກັດເອົາເອງ, ຫຼືການເຊື່ອມໂຊມທີ່ເກີດຈາກຂະບວນການສະກັດເອົາ;ເທົ່າທີ່ເປັນໄປໄດ້, ຄວນໃຊ້ຕົວຢ່າງສົດເພື່ອສະກັດເອົາ RNA, ແລະຕົວຢ່າງທີ່ເກັບໄດ້ຄວນຈະຖືກເກັບໄວ້ໃນຕູ້ເຢັນໄນໂຕຣເຈນຂອງແຫຼວຫຼື -80 ° C ໃນເວລາ, ແລະການແຊ່ແຂໍງແລະການແຊ່ນ້ໍາຊ້ໍາຊ້ອນ.ຄໍາແນະນໍາທີ່ບໍ່ມີ RNase/DNase, ທໍ່ centrifuge ແລະອຸປະກອນອື່ນໆຄວນຖືກນໍາໃຊ້ໃນຂະບວນການສະກັດເອົາ RNA.ຂະບວນການສະກັດເອົາຄວນຈະໄວເທົ່າທີ່ຈະໄວໄດ້.RNA ທີ່ສະກັດໄດ້ຄວນຈະຖືກວາງໄວ້ໃນກ່ອງກ້ອນແລະເກັບຮັກສາໄວ້ໃນເວລາ -80.ຖ້າ RNA ທີ່ສະກັດອອກມາຕ້ອງໄດ້ຮັບການກວດພົບໂດຍ electrophoresis gel, electrophoresis ຄວນໄດ້ຮັບການປະຕິບັດທັນທີຫຼັງຈາກການສະກັດເອົາ, ແລະ buffer electrophoresis ຄວນຖືກປ່ຽນແທນດ້ວຍເຄື່ອງທີ່ກຽມໄວ້ໃຫມ່.
 
4. ເກືອ ແລະ ສານລະລາຍປອດສານພິດ
ສານສະກັດຈາກສານສະກັດປະກອບດ້ວຍເກືອ phenol ແລະ guanidine, ແລະການແກ້ໄຂການລ້າງປະກອບດ້ວຍເອທານອນ.ໃນລະຫວ່າງການຂະບວນການສະກັດເອົາ, lysate ບໍ່ໄດ້ຖືກດູດຊຶມຢ່າງສົມບູນແລະຖືກຍົກເລີກ, ແລະການແກ້ໄຂການລ້າງບໍ່ໄດ້ຕາກໃຫ້ແຫ້ງຢ່າງເຕັມທີ່.ເກືອທີ່ຕົກຄ້າງ ແລະສານລະລາຍປອດສານພິດແມ່ນເປັນອັນຕະລາຍຕໍ່ການຖອດຖອນຄືນຫຼັງ ແລະ PCR.ລະດັບການຍັບຍັ້ງທີ່ແຕກຕ່າງກັນ, ດັ່ງນັ້ນເນື້ອເຍື່ອ lysate ຄວນໄດ້ຮັບການໂຍກຍ້າຍອອກຢ່າງເຕັມທີ່ໃນລະຫວ່າງການສະກັດເອົາ, ແລະການລ້າງຄວນຈະພຽງພໍເພື່ອໃຫ້ຝາອ້ອມຂ້າງຂອງທໍ່ສາມາດລ້າງໄດ້.ນອກຈາກນັ້ນ, ທໍ່ຖືກເປົ່າແລະເປົ່າແມ່ນຂັ້ນຕອນທີ່ຈໍາເປັນ, ເຊິ່ງຈະຊ່ວຍຫຼຸດຜ່ອນການຕົກຄ້າງຂອງສານອິນຊີຕື່ມອີກ.
 
ສໍາລັບຂໍ້ມູນເພີ່ມເຕີມກ່ຽວກັບການສະກັດເອົາ RNA, ກະລຸນາຕິດຕາມເວັບໄຊທ໌ຂອງພວກເຮົາ:
www.foreivd.com ສໍາລັບຂໍ້ມູນເພີ່ມເຕີມ.

7

ເວລາປະກາດ: ວັນທີ 01-01-2022