Fluorescence quantitative PCR (ຊຶ່ງເອີ້ນກັນວ່າ TaqMan PCR, ຕໍ່ໄປນີ້ເອີ້ນວ່າ FQ-PCR) ເປັນເທກໂນໂລຍີປະລິມານອາຊິດນິວຄລີອິກໃຫມ່ທີ່ພັດທະນາໂດຍ PE (Perkin Elmer) ໃນສະຫະລັດອາເມລິກາໃນປີ 1995. ເຕັກໂນໂລຢີນີ້ແມ່ນອີງໃສ່ PCR ທໍາມະດາໂດຍການເພີ່ມ probes ທີ່ມີປ້າຍ fluorescent.ເມື່ອປຽບທຽບກັບ PCR ທີ່ມີຄວາມຍືດຫຍຸ່ນ, FQ-PCR ມີຄວາມໄດ້ປຽບຫຼາຍທີ່ຈະຮັບຮູ້ການທໍາງານຂອງປະລິມານຂອງມັນ.ບົດ​ຄວາມ​ນີ້​ຈະ​ອະ​ທິ​ບາຍ​ໂດຍ​ຫຍໍ້​ກ່ຽວ​ກັບ​ລັກ​ສະ​ນະ​, ຫຼັກ​ການ​, ວິ​ທີ​ການ​, ແລະ​ການ​ນໍາ​ໃຊ້​ເຕັກ​ໂນ​ໂລ​ຊີ​.

1 ຄຸນສົມບັດ

FQ-PCR ບໍ່ພຽງແຕ່ມີຄວາມອ່ອນໄຫວສູງຂອງ PCR ທໍາມະດາ, ແຕ່ຍັງເນື່ອງຈາກວ່າການນໍາໃຊ້ຂອງ probes fluorescent, ມັນສາມາດກວດພົບໂດຍກົງການປ່ຽນແປງຂອງສັນຍານ fluorescent ໃນລະຫວ່າງການຂະຫຍາຍ PCR ຜ່ານລະບົບການນໍາ photoelectric ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຮັບຜົນໄດ້ຮັບປະລິມານ, ເຊິ່ງ overcomes ການຂາດແຄນຈໍານວນຫຼາຍຂອງ PCR ທໍາມະດາ, ສະນັ້ນມັນຍັງມີຄວາມສະເພາະຂອງເຕັກໂນໂລຊີ DNA hybrid hybridization ສູງ.

ສໍາລັບຕົວຢ່າງ, ຜະລິດຕະພັນ PCR ທົ່ວໄປຕ້ອງໄດ້ຮັບການສັງເກດເຫັນໂດຍ electrophoresis gel agarose ແລະ ethidium bromide staining ກັບແສງ ultraviolet ຫຼືໂດຍ electrophoresis gel polyacrylamide ແລະການ staining ເງິນ.ນີ້ບໍ່ພຽງແຕ່ຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີເຄື່ອງມືຫຼາຍ, ແຕ່ຍັງໃຊ້ເວລາແລະຄວາມພະຍາຍາມ.ຮອຍເປື້ອນທີ່ໃຊ້ Ethidium bromide ແມ່ນເປັນອັນຕະລາຍຕໍ່ຮ່າງກາຍຂອງມະນຸດ, ແລະຂັ້ນຕອນການທົດລອງທີ່ສັບສົນເຫຼົ່ານີ້ໃຫ້ໂອກາດສໍາລັບມົນລະພິດແລະຜົນບວກທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ.ຢ່າງໃດກໍຕາມ, FQ-PCR ພຽງແຕ່ຕ້ອງການເປີດຝາຫນຶ່ງຄັ້ງໃນລະຫວ່າງການໂຫຼດຕົວຢ່າງ, ແລະຂະບວນການຕໍ່ມາແມ່ນການດໍາເນີນງານທໍ່ປິດຢ່າງສົມບູນ, ເຊິ່ງບໍ່ຈໍາເປັນຕ້ອງມີ PCR ຫລັງການປຸງແຕ່ງ, ຫຼີກເວັ້ນຂໍ້ເສຍຫຼາຍໃນການດໍາເນີນງານ PCR ທໍາມະດາ.ການທົດລອງໂດຍທົ່ວໄປແລ້ວຈະໃຊ້ເຄື່ອງຈັກລະບາຍຄວາມຮ້ອນ ABI7100 PCR ທີ່ພັດທະນາໂດຍບໍລິສັດ PE.

ເຄື່ອງມືດັ່ງກ່າວມີລັກສະນະດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້: ①ຄໍາຮ້ອງສະຫມັກກ້ວາງ: ມັນສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການກໍານົດປະລິມານຜະລິດຕະພັນ DNA ແລະ RNA PCR, ການຄົ້ນຄວ້າການສະແດງອອກຂອງເຊື້ອ, ການກວດຫາເຊື້ອພະຍາດ, ແລະການເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງສະພາບ PCR.② ຫຼັກການປະລິມານທີ່ເປັນເອກະລັກ: ການນໍາໃຊ້ probes ຕິດສະຫຼາກ fluorescently, ປະລິມານຂອງ fluorescence ຈະສະສົມກັບວົງຈອນ PCR ຫຼັງຈາກ excitation laser, ເພື່ອບັນລຸຈຸດປະສົງຂອງປະລິມານ.③ ປະສິດທິພາບການເຮັດວຽກສູງ: Built-in 9600 PCR cycler ຄວາມຮ້ອນ, ຄອມພິວເຕີຄວບຄຸມ 1 ຫາ 2 ຊົ່ວໂມງເພື່ອສໍາເລັດການຂະຫຍາຍແລະປະລິມານຂອງ 96 ຕົວຢ່າງອັດຕະໂນມັດແລະ synchronously.④ ບໍ່ຈໍາເປັນຕ້ອງໃຊ້ gel electrophoresis: ບໍ່ຈໍາເປັນຕ້ອງເຈືອຈາງແລະ electrophoresis ຕົວຢ່າງ, ພຽງແຕ່ໃຊ້ probe ພິເສດເພື່ອກວດຫາໂດຍກົງໃນທໍ່ຕິກິຣິຍາ.⑤​ບໍ່​ມີ​ມົນ​ລະ​ພິດ​ໃນ​ທໍ່​: ໄດ້​ຮັບ​ຮອງ​ເອົາ​ທໍ່​ຕິ​ກິ​ຣິ​ຍາ​ປິດ​ຢ່າງ​ເຕັມ​ທີ່​ເປັນ​ເອ​ກະ​ລັກ​ແລະ​ລະ​ບົບ photoelectric conduction​, ດັ່ງ​ນັ້ນ​ບໍ່​ຈໍາ​ເປັນ​ຕ້ອງ​ກັງ​ວົນ​ກ່ຽວ​ກັບ​ມົນ​ລະ​ພິດ​.⑥ ຜົນ​ໄດ້​ຮັບ​ແມ່ນ​ເຮັດ​ໃຫ້​ເກີດ​ໃຫມ່​: ລະ​ດັບ​ການ​ເຄື່ອນ​ໄຫວ​ປະ​ລິ​ມານ​ແມ່ນ​ສູງ​ເຖິງ​ຫ້າ​ຄໍາ​ສັ່ງ​ຂອງ​ຂະ​ຫນາດ​.ດັ່ງນັ້ນ, ນັບຕັ້ງແຕ່ເຕັກໂນໂລຊີນີ້ໄດ້ຖືກພັດທະນາຢ່າງສໍາເລັດຜົນ, ມັນໄດ້ຖືກຕີລາຄາໂດຍນັກຄົ້ນຄວ້າວິທະຍາສາດຈໍານວນຫຼາຍແລະໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ໃນຫຼາຍຂົງເຂດ.

2 ຫຼັກການ ແລະ ວິທີການ

ຫຼັກການເຮັດວຽກຂອງ FQ-PCR ແມ່ນເພື່ອນໍາໃຊ້ກິດຈະກໍາ exonuclease 5′→3′ ຂອງ enzyme Taq ເພື່ອເພີ່ມ probe ທີ່ມີປ້າຍ fluorescently ກັບລະບົບຕິກິຣິຍາ PCR.ການສືບສວນສາມາດປະສົມໂດຍສະເພາະກັບແມ່ແບບ DNA ທີ່ມີຢູ່ໃນລໍາດັບ primer.ປາຍ 5′ ຂອງ probe ຖືກຕິດສະຫຼາກດ້ວຍ gene ການປ່ອຍ fluorescence FAM (6-carboxyfluorescein, ສູງສຸດ 518nm emission fluorescence), ແລະ 3′ end ຖືກຕິດສະຫຼາກດ້ວຍ The fluorescence quenching group TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, the fluorescence 2′), ທາດ fluorescence 2. phosphorylated ເພື່ອປ້ອງກັນບໍ່ໃຫ້ probe ຂະຫຍາຍອອກໄປໃນລະຫວ່າງການຂະຫຍາຍ PCR.ໃນເວລາທີ່ probe ຍັງຄົງ intact, ກຸ່ມ quencher ສະກັດກັ້ນການປ່ອຍອາຍພິດ fluorescence ຂອງກຸ່ມ emitting.ເມື່ອກຸ່ມ emitting ຖືກແຍກອອກຈາກກຸ່ມ quenching, inhibition ໄດ້ຖືກຍົກຂຶ້ນ, ແລະຄວາມຫນາແຫນ້ນຂອງ optical ທີ່ 518nm ເພີ່ມຂຶ້ນແລະຖືກກວດພົບໂດຍລະບົບກວດຫາ fluorescence. ໃນໄລຍະ renaturation, probe ປະສົມກັບແມ່ແບບ DNA, ແລະ enzyme Taq ໃນໄລຍະການຂະຫຍາຍຍ້າຍອອກໄປຕາມຕົວແບບ DNA primer.ໃນເວລາທີ່ probe ໄດ້ຖືກຕັດອອກ, ຜົນກະທົບ quenching ໄດ້ຖືກປ່ອຍອອກມາແລະສັນຍານ fluorescent ຖືກປ່ອຍອອກມາ.ທຸກໆຄັ້ງທີ່ແມ່ແບບໄດ້ຖືກຄັດລອກ, probe ຖືກຕັດອອກ, ພ້ອມກັບການປ່ອຍສັນຍານ fluorescent.ເນື່ອງຈາກມີການພົວພັນຫນຶ່ງຕໍ່ຫນຶ່ງລະຫວ່າງຈໍານວນຂອງ fluorophores ທີ່ປ່ອຍອອກມາແລະຈໍານວນຂອງຜະລິດຕະພັນ PCR, ເຕັກນິກນີ້ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກໍານົດປະລິມານຂອງແມ່ແບບຢ່າງຖືກຕ້ອງ.ໂດຍທົ່ວໄປແລ້ວ ເຄື່ອງມືທົດລອງໃຊ້ເຄື່ອງໄຊ້ຄວາມຮ້ອນ ABI7100 PCR ທີ່ພັດທະນາໂດຍບໍລິສັດ PE, ແລະເຄື່ອງປັ່ນຄວາມຮ້ອນອື່ນໆສາມາດນຳໃຊ້ໄດ້ເຊັ່ນກັນ.ຖ້າລະບົບຕິກິຣິຍາປະເພດ ABI7700 ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການທົດລອງ, ຫຼັງຈາກປະຕິກິລິຢາສໍາເລັດ, ຜົນໄດ້ຮັບທາງດ້ານປະລິມານສາມາດໃຫ້ໂດຍກົງຜ່ານການວິເຄາະຄອມພິວເຕີ.ຖ້າທ່ານໃຊ້ເຄື່ອງກວດຄວາມຮ້ອນອື່ນໆ, ທ່ານຈໍາເປັນຕ້ອງໃຊ້ເຄື່ອງກວດຈັບ fluorescence ເພື່ອວັດແທກສັນຍານ fluorescence ໃນທໍ່ຕິກິຣິຍາໃນເວລາດຽວກັນເພື່ອຄິດໄລ່ RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ ເປັນຕົວແທນອັດຕາສ່ວນຄວາມເຂັ້ມຂອງ luminescence ຂອງກຸ່ມການປ່ອຍອາຍພິດ fluorescent ຂອງທໍ່ຕົວຢ່າງຕໍ່ກັບຄວາມເຂັ້ມງວດ luminescence ຂອງກຸ່ມ quenching, RQ- ເປັນຕົວແທນອັດຕາສ່ວນຂອງທັງສອງໃນທໍ່ເປົ່າ, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) ເປັນຕົວແທນຂອງຈໍານວນຜົນໄດ້ຮັບຂອງສັນຍານ PC RQ ສາມາດປ່ຽນແປງໄດ້.ເນື່ອງຈາກການແນະນໍາຂອງ probes fluorescent, ສະເພາະຂອງການທົດລອງໄດ້ຖືກປັບປຸງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ.ໂດຍທົ່ວໄປແລ້ວການອອກແບບ probe ຄວນຕອບສະຫນອງເງື່ອນໄຂດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້: ①ຄວາມຍາວຂອງ probe ຄວນຈະປະມານ 20-40 ຖານເພື່ອຮັບປະກັນຄວາມສະເພາະຂອງການຜູກມັດ.②​ເນື້ອ​ໃນ​ຂອງ​ຖານ GC ແມ່ນ​ຢູ່​ລະ​ຫວ່າງ 40​% ແລະ 60​% ເພື່ອ​ຫຼີກ​ເວັ້ນ​ການ​ຊໍ້າ​ຊ້ອນ​ຂອງ​ລໍາ​ດັບ nucleotide ດຽວ​.③ ຫຼີກເວັ້ນການປະສົມຫຼືຊ້ອນກັນກັບ primers.④ ຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງການຜູກມັດລະຫວ່າງ probe ແລະແມ່ແບບແມ່ນຫຼາຍກ່ວາຄວາມຫມັ້ນຄົງຂອງການຜູກມັດລະຫວ່າງ primer ແລະແມ່ແບບ, ສະນັ້ນຄ່າ Tm ຂອງ probe ຄວນຈະມີຢ່າງຫນ້ອຍ 5 ° C ສູງກວ່າຄ່າ Tm ຂອງ primer.ນອກຈາກນັ້ນ, ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ probe, ຄວາມຄ້າຍຄືກັນລະຫວ່າງ probe ແລະລໍາດັບແບບແມ່ແບບ, ແລະໄລຍະຫ່າງລະຫວ່າງ probe ແລະ primer ທັງຫມົດມີຜົນກະທົບຕໍ່ຜົນການທົດລອງ.

ຜະ​ລິດ​ຕະ​ພັນ​ທີ່​ກ່ຽວ​ຂ້ອງ:

China Lnc-RT Heroᵀᴹ I(With gDNase)(Super Premix for first-strand cDNA synthesis from lncRNA) ຜູ້ຜະລິດ ແລະ ຈຳໜ່າຍ |Foregene (foreivd.com)

China Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman ຜູ້ຜະລິດແລະຜູ້ສະຫນອງ |Foregene (foreivd.com)