ການກວດສອບການປະຕິບັດຂອງ primers ແລະ probes ໃນໄລຍະຕົ້ນຂອງ PCR reagents ແລະການກໍານົດເງື່ອນໄຂການຕິກິຣິຍາທີ່ເຫມາະສົມທີ່ສຸດແມ່ນເງື່ອນໄຂເບື້ອງຕົ້ນເພື່ອຮັບປະກັນຄວາມກ້າວຫນ້າຂອງການທົດລອງຢ່າງເປັນທາງການ.
ດັ່ງນັ້ນພວກເຮົາຈໍາເປັນຕ້ອງຢືນຢັນການ probe primer ໃນໄລຍະຕົ້ນແນວໃດ?
ຕົວຊີ້ວັດຕົ້ນຕໍແມ່ນພື້ນຖານ, ເສັ້ນໂຄ້ງຂະຫຍາຍ, ຄ່າ ct, ປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍ, ການກວດຫາຕົວຢ່າງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຕໍ່າ, CV, ແລະອື່ນໆ.
ພື້ນຖານ
ເສັ້ນພື້ນຖານແມ່ນເສັ້ນແນວນອນໃນເສັ້ນໂຄ້ງຂະຫຍາຍ PCR.ໃນສອງສາມຮອບທໍາອິດຂອງປະຕິກິລິຍາການຂະຫຍາຍ PCR, ສັນຍານ fluorescence ບໍ່ປ່ຽນແປງຫຼາຍແລະປະກອບເປັນເສັ້ນຊື່.ເສັ້ນຊື່ນີ້ແມ່ນເສັ້ນພື້ນຖານ.
ເມື່ອກວດກາ PCR primer probes, ຈົ່ງເອົາໃຈໃສ່ວ່າເສັ້ນພື້ນຖານແມ່ນລະດັບ.ຄວາມບໍລິສຸດຂອງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ primer probe ຈະສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ເສັ້ນພື້ນຖານ, ເຊັ່ນວ່າເຮັດໃຫ້ເສັ້ນພື້ນຖານເພີ່ມຂຶ້ນຫຼືຫຼຸດລົງ.ເສັ້ນພື້ນຖານຍັງເປັນຕົວຊີ້ວັດ intuitive ຫຼາຍ.
ເສັ້ນໂຄ້ງຂະຫຍາຍ
ຕົວຊີ້ບອກ intuitive ອີກອັນຫນຶ່ງແມ່ນຮູບຮ່າງຂອງເສັ້ນໂຄ້ງການຂະຫຍາຍ.ມັນດີທີ່ສຸດທີ່ຈະມີເສັ້ນໂຄ້ງຮູບ S ເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການຂະຫຍາຍຂັ້ນສອງຫຼືເສັ້ນໂຄ້ງການຂະຫຍາຍທີ່ຜິດປົກກະຕິອື່ນໆ.
ຄ່າ Ct
ຈໍານວນຂອງຮອບວຽນທີ່ສອດຄ້ອງກັບຈຸດ inflection ຈາກເສັ້ນພື້ນຖານໄປສູ່ການຂະຫຍາຍຕົວຂອງເລກກໍາລັງແມ່ນຄ່າ Ct.
ສໍາລັບຕົວຢ່າງດຽວກັນ, probes primer ທີ່ແຕກຕ່າງກັນສົ່ງຜົນໃຫ້ມີເສັ້ນໂຄ້ງຂະຫຍາຍທີ່ແຕກຕ່າງກັນ, ແລະຄ່າ Ct ທີ່ສອດຄ້ອງກັນຈະໄດ້ຮັບຜົນກະທົບໂດຍປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍຕົວແລະລະດັບ interference.ໃນທາງທິດສະດີ, ຄ່າ Ct ນ້ອຍກວ່າຂອງ primer probe ພວກເຮົາເລືອກ, ທີ່ດີກວ່າ.
ປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍ
ຫນຶ່ງໃນວິທີການທີ່ເຊື່ອຖືໄດ້ແລະຫມັ້ນຄົງທີ່ສຸດສໍາລັບການປະເມີນປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍ PCR ແມ່ນເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານ, ເຊິ່ງຍັງໄດ້ຮັບການຍອມຮັບຢ່າງກວ້າງຂວາງໂດຍນັກຄົ້ນຄວ້າ.ວິທີການປະກອບມີການສ້າງຊຸດຕົວຢ່າງເພື່ອຄວບຄຸມຈໍານວນແມ່ແບບເປົ້າຫມາຍທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ.ຕົວຢ່າງເຫຼົ່ານີ້ປົກກະຕິແລ້ວແມ່ນເຮັດໂດຍການເຈືອຈາງ serial ຂອງການແກ້ໄຂຫຼັກຊັບທີ່ເຂັ້ມຂຸ້ນ, ການນໍາໃຊ້ທົ່ວໄປທີ່ສຸດແມ່ນການເຈືອຈາງ 10 ເທົ່າ.ການນໍາໃຊ້ຊຸດຂອງຕົວຢ່າງທີ່ເຈືອຈາງ, ການນໍາໃຊ້ໂຄງການ qPCR ມາດຕະຖານເພື່ອຂະຫຍາຍເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຄ່າ Cq, ແລະສຸດທ້າຍແຕ້ມເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານຕາມຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງແຕ່ລະຕົວຢ່າງແລະຄ່າ Cq ທີ່ສອດຄ້ອງກັນເພື່ອໃຫ້ໄດ້ສົມຜົນເສັ້ນຊື່ Cq = -klgX0+b, ແລະປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍ E = 10(-1 / k)-1.ເມື່ອໃຊ້ qPCR ສໍາລັບການວິເຄາະດ້ານປະລິມານ, ປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍແມ່ນຕ້ອງການຢູ່ໃນລະດັບ 90%-110% (3.6>k>3.1).
ການກວດຫາຕົວຢ່າງທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຕໍ່າ
ເມື່ອຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງຕົວຢ່າງຕໍ່າ, ອັດຕາການກວດພົບຂອງ probes primer ທີ່ແຕກຕ່າງກັນແມ່ນແຕກຕ່າງກັນ.ພວກເຮົາເລືອກເອົາ 20 ຕົວຢ່າງທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຕ່ໍາເພື່ອເຮັດຊ້ໍາກັນ, ແລະລະບົບ primer-probe ທີ່ມີອັດຕາການກວດພົບສູງສຸດແມ່ນດີທີ່ສຸດ.
ຄ່າສໍາປະສິດຂອງການປ່ຽນແປງ (CV)
10 ຕົວຢ່າງທີ່ຊ້ໍາກັນສາມາດກວດພົບໄດ້ດ້ວຍເຄື່ອງກວດ primer ທີ່ແຕກຕ່າງກັນຕາມມາດຕະຖານສາຍຂອງ reagent ສໍາລັບການກວດສອບການຂະຫຍາຍອາຊິດນິວຄລີອິກ.
Reagents ປະລິມານ:
ຄວາມຖືກຕ້ອງ
ຄວາມຖືກຕ້ອງພາຍໃນຫນຶ່ງ batch ຄວນຕອບສະຫນອງ: ຕົວຄູນຂອງການປ່ຽນແປງ (CV,%) ຂອງຄ່າ logarithmic ຂອງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງການທົດສອບແມ່ນ ≤5%.ເມື່ອຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງຕົວຢ່າງແມ່ນຕໍ່າ, ຄ່າສໍາປະສິດຂອງການປ່ຽນແປງ (CV,%) ຂອງ logarithm ຂອງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງການກວດສອບແມ່ນ ≤10%
reagents ຄຸນນະພາບ:
ຄວາມຖືກຕ້ອງ
ຄວາມຖືກຕ້ອງພາຍໃນຫນຶ່ງຊຸດຄວນຕອບສະຫນອງ:
(1) ຄ່າສໍາປະສິດຂອງການປ່ຽນແປງຂອງຄ່າ Ct (CV,%) ≤5%
ຕົວຢ່າງດຽວກັນໄດ້ຖືກທົດສອບໃນຂະຫນານ 10 ເທື່ອ, ແລະຜົນການທົດສອບຄວນຈະສອດຄ່ອງ
ເວລາປະກາດ: ກັນຍາ-18-2021
